Simplifiez-vous la vie avec la PCR : stratégies pour une préparation facile

Ce qu’il faut savoir sur la PCR

La PCR est utilisée dans les domaines de la biologie moléculaire, du diagnostic et du séquençage. Cette technique est devenue célèbre lors de la pandémie de COVID-19, lorsque la PCR avec transcription inverse (RT-PCR) a été utilisée pour détecter l’ARN du SARS-CoV-2. Le protocole précis de la PCR dépend du type de matériel de départ et des informations que l’on souhaite obtenir grâce au test, mais il commence toujours par la préparation du master mix. Cette opération consiste à calculer le volume de chaque réactif nécessaire pour obtenir la concentration finale souhaitée dans chaque réaction. On introduit ensuite à l’aide d’une pipette, dans un seul tube, de l’eau de qualité PCR, des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP), des amorces sens et antisens, de l’ADN polymérase, un tampon et du chlorure de magnésium, puis on mélange soigneusement le tout. Pour les protocoles de réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR), un colorant intercalant ou une sonde fluorescente est également inclus, afin de suivre l’amplification à mesure qu’elle se produit. Ce master mix est ensuite aliquoté dans des tubes, des barrettes ou des plaques PCR, puis on y ajoute les matrices d’ADN ou d’ADNc individuelles. En effet, il est plus facile de distribuer un échantillon de faible volume dans un liquide plutôt que dans un tube vide, ce qui réduit le risque d’aérosolisation et de contamination croisée.

Les réactions préparées sont ensuite placées dans un thermocycleur. Une PCR standard comprend généralement entre 25 et 40 cycles, la quantité d’ADN cible doublant théoriquement à chaque cycle pour générer des millions, voire des milliards de copies. Chaque cycle commence par une dénaturation qui sépare les deux brins de l’ADN, avant que la température ne soit abaissée pour permettre aux amorces de s’hybrider aux séquences correspondantes flanquant la région cible. Au cours de la phase d’extension, l’ADN polymérase produit des copies complémentaires de la séquence cible.

La dernière étape du processus dépend du type de PCR réalisé ; dans le cas de la PCR en point final, les produits amplifiés sont analysés après les cycles thermiques, généralement par électrophorèse sur gel, spectrophotométrie ou fluorimétrie. Dans la qPCR, le signal fluorescent est mesuré tout au long des cycles thermiques. La fluorescence augmente généralement proportionnellement à la quantité de produit de PCR, ce qui permet à l’appareil de calculer une valeur de seuil de cycle et de suivre l’amplification en temps réel. L’ADN amplifié peut ensuite être purifié afin d’éliminer les amorces inutilisées, les nucléotides, les enzymes, les sels et d’autres contaminants avant le séquençage ou une analyse ultérieure.

Les goulots d’étranglement lors de la préparation de la PCR (et comment les surmonter)

La PCR est une technique relativement courante et simple, mais elle comporte néanmoins plusieurs difficultés.

Préparation du master mix

Les calculs nécessaires à la préparation du master mix doivent tenir compte des concentrations initiales et finales, des volumes de réaction et du nombre d’échantillons, et même des erreurs mineures peuvent avoir une incidence sur le test. En cas d’interruptions pendant la préparation du master mix, les chercheurs peuvent ne plus savoir quels composants ont déjà été ajoutés. Cela peut avoir pour conséquence des volumes ou des concentrations de réactifs incorrects, ce qui peut empêcher l’amplification dans les échantillons ou les contrôles positifs. Le pipetage manuel de liquides visqueux ou collants peut également s’avérer difficile, car des résidus peuvent rester dans les embouts de pipette ou sur le matériel de laboratoire, ce qui souligne l’importance d’utiliser des embouts à faible rétention pour les réactifs visqueux ou à faible tension superficielle.

Autre problème lié aux procédures de pipetage longues : des réactifs précieux peuvent être perdus par évaporation, ou des réactifs sensibles à la température peuvent perdre de leur efficacité. Il est donc recommandé de conserver les réactifs PCR et les échantillons au frais tout au long de la préparation, ce qui complique encore davantage la manipulation manuelle des liquides. Les composants doivent également être ajoutés dans un ordre défini, avec un suivi clair des ajouts, en commençant par les réactifs les moins coûteux afin de limiter le gaspillage en cas d’erreur précoce. Il est également recommandé de préparer un seul lot de master mix pour l’ensemble de la série de PCR, en y incluant une aliquote supplémentaire afin de compenser les pertes. Cela permet de garantir une composition identique en réactifs pour chaque réaction, ce qui réduit la variabilité expérimentale. Cela permet également de pipeter des volumes plus importants de chaque réactif – ce qui améliore généralement la précision – et de réduire le nombre total de transferts, pour une préparation moins fatigante et moins sujette aux erreurs.

Transferts de liquide répétitifs

La distribution du master mix dans les tubes de réaction est l’une des étapes les plus répétitives de la PCR. Le remplissage individuel de tubes, de barrettes ou de plaques à l’aide d’une pipette manuelle monocanal est un processus lent qui augmente le risque d’oublier ou de dupliquer des réactions. L’ajout d’échantillons demande également une aspiration et un dosage précis de petits volumes, tandis que le transfert des échantillons et des réactifs d’un récipient de laboratoire à un autre augmente le risque d’erreurs de positionnement. Conjugué aux opérations répétées de chargement et d’éjection des embouts, cela rend la préparation d’une plaque PCR exigeante tant sur le plan physique que mental, et peut accroître le risque d’erreurs et de contamination.

Les dispositifs manuels multicanaux, tels que les pipettes ergonomiques légères EVOLVE, permettent de remplir plusieurs puits simultanément tout en offrant une prise en main familière et intuitive. Ils s’avèrent particulièrement utiles pour les séries de tests à grande échelle, où l’on dispose d’une quantité suffisante de master mix pour utiliser des réservoirs à réactifs à faible volume mort, ce qui permet de réduire au minimum le gaspillage. Par ailleurs, les pipettes électroniques offrent une plus grande rapidité et une meilleure reproductibilité pour les transferts répétitifs. Les pipettes électroniques VIAFLO offrent un mode de distribution répétée ainsi que d’autres modes programmables, ce qui permet de distribuer plusieurs aliquotes homogènes à partir d’une seule aspiration. Pour encore plus de flexibilité, les pipettes à écartement automatique des pointes VOYAGER peuvent modifier automatiquement l’espacement entre les pointes, ce qui facilite les transferts et les changements de format entre les tubes, les racks et les plaques, tout en réduisant au minimum les erreurs de positionnement.

Pour les flux de travail à débit moyen à élevé, les pipettes électroniques MINI 96, VIAFLO 96 et VIAFLO 384 permettent de transférer simultanément le contenu de tout ou partie des puits d’une plaque, ce qui améliore la productivité et la reproductibilité tout en réduisant les manipulations manuelles. Le robot de pipetage ASSIST PLUS, équipé d’une pipette VIAFLO ou VOYAGER, ou du module de pipetage monocanal D-ONE, permet d’automatiser entièrement la préparation et la distribution des master mix, ainsi que les transferts d’échantillons, ce qui contribue à limiter la contamination et à réduire les interventions manuelles.

Prévention de la contamination

La contamination constitue un risque majeur lors de la préparation d’une PCR, car la présence de quantités infimes de matériel génétique provenant de l’environnement du laboratoire – voire d’ADN provenant d’échantillons ou de produits amplifiés issus d’autres puits – peut entraîner des résultats erronés. Pour éviter cela, les réactions PCR doivent être préparées dans une hotte à flux laminaire décontaminée ou dans une enceinte de sécurité biologique, à l’aide d’embouts de pipette stériles à filtre. La préparation du master mix, la préparation des échantillons, l’amplification et l’analyse des produits doivent toutes être réalisées dans des espaces distincts dans la mesure du possible, avec des pipettes dédiées à chaque tâche. Il convient de respecter un flux de travail unidirectionnel, et le matériel ne doit pas être ramené des zones post-PCR vers les zones pré-PCR sans avoir fait l’objet d’une décontamination minutieuse. Les réactifs de réserve doivent également être divisés en aliquotes plus petites afin d’éviter que l’ensemble du stock ne soit perdu si une aliquote venait à être contaminée.

Une seule pointe, ou un seul jeu de pointes, peut généralement être utilisé pour distribuer le master mix à condition de respecter les mesures de prévention de la contamination appropriées, ce qui permet de réduire la consommation de pointes sans risquer de transférer du matériel d’un échantillon à l’autre. Il faut ensuite utiliser une nouvelle pointe pour chaque échantillon afin d’éviter toute contamination croisée. Des contrôles positifs et négatifs doivent également être inclus dans chaque série d’analyses afin de détecter à un stade précoce les échecs d’amplification ou les contaminations. Notre guide de préparation d’un laboratoire PCR fournit des informations complémentaires sur l’organisation du laboratoire et la prévention de la contamination.

Simplifier la préparation PCR

Au laboratoire, le temps est précieux et, avec la PCR, le gain de temps principal provient du fait qu’il n’est plus nécessaire de procéder à des aspirations répétées ni de changer régulièrement de pipette. Pour les PCR à débit faible à modéré, les chercheurs souhaitent souvent combiner la précision d’une pipette manuelle monocanal – pour la préparation du master mix et l’ajout de la matrice – à un système de distribution répétée permettant un aliquotage efficace. La pipette hybride SWITCH combine ces deux fonctions dans un seul appareil, ce qui permet aux utilisateurs de passer du mode manuel au mode de distribution répétée électronique sans avoir à changer d’instrument. Une molette de réglage rapide permet de régler le volume d’une seule main, et la distribution répétée ne nécessite que trois réglages, ce qui évite toute programmation complexe.

Rapidité et efficacité

La SWITCH permet aux utilisateurs de préparer manuellement un master mix, de passer en mode de distribution répétée pour le distribuer dans les tubes, les barrettes ou les plaques PCR, puis de revenir en mode manuel pour ajouter des matrices d’ADN ou d’ADNc individuelles. Distribuer plusieurs aliquotes à partir d’une seule aspiration permet de réduire le nombre total d’étapes de pipetage répétitives et de limiter la variabilité liée au pipetage manuel répétitif.

La SWITCH utilise des embouts de pipette GRIPTIPS^®, disponibles en versions stériles et filtrantes, certifiées exemptes de RNase, de DNase et d’inhibiteurs de PCR. L’utilisation d’embouts filtrants permet d’empêcher les aérosols de pénétrer dans la pipette – réduisant ainsi le risque de contamination croisée – et l’utilisation d’embouts à faible rétention et à large ouverture peut améliorer la récupération des master mix et des échantillons précieux, tout en augmentant la précision du pipetage lors de la manipulation de liquides difficiles.

Ergonomie améliorée

La réduction du nombre de mouvements de pipetage manuels nécessaires lors de la préparation d’une PCR permet non seulement d’augmenter le débit, mais aussi de réduire le risque de microtraumatismes répétés à long terme. Le piston de la SWITCH ne nécessite qu’une faible force d’actionnement et conserve une hauteur constante quel que soit le réglage du volume, ce qui limite l’étirement excessif du pouce. La hauteur du piston est même réduite en mode de distribution répétée, ce qui permet au pouce de rester plus proche d’une position neutre. Toutes ces caractéristiques font de la SWITCH un choix plus confortable et plus ergonomique pour les flux de travail PCR à faible débit.

Simplifier la purification après PCR

Les produits de la PCR peuvent contenir des amorces inutilisées, des nucléotides, de la polymérase, des sels et des produits d’amplification non spécifiques susceptibles d’interférer avec les étapes ultérieures. Parmi les méthodes de purification courantes, on peut citer les colonnes de purification et les billes magnétiques, telles que les billes magnétiques MAGFLO™ NGS, destinées à la sélection par taille pour le séquençage de nouvelle génération (NGS) et à la purification après PCR. Les billes MAGFLO éliminent efficacement les résidus d’amorces, de nucléotides, d’enzymes et de sels avant les analyses en aval pour des résultats plus reproductibles. Elles permettent généralement de récupérer au moins 85 % des acides nucléiques et peuvent être utilisées dans le cadre de protocoles manuels ou automatisés pouvant traiter jusqu’à 384 échantillons. Ces billes peuvent être utilisées avec les modules de purification par billes magnétiques MAG et HEATMAG, qui effectuent une séparation magnétique verticale automatisée. Cela garantit une collecte rapide des billes avec un minimum de pertes et de contamination croisée, et les billes sont rassemblées en un seul point, plutôt que de former un culot en forme d’anneau. Cela facilite l’aspiration du surnageant sans perturber les billes et évite d’avoir à transporter les plaques entre le poste de pipetage et un support magnétique séparé. Les systèmes MAG et HEATMAG peuvent être utilisés avec les pipettes VIAFLO 96 ou VIAFLO 384 pour une purification à haut débit, ou de manière automatisée sur l’ASSIST PLUS, offrant ainsi une purification par billes magnétiques entièrement autonome, sans nécessiter de pinces ni de bras robotiques coûteux.

Optimisation de bout en bout

La préparation d’une PCR est plus exigeante qu’il n’y paraît, car les petits volumes, les réactifs coûteux et les transferts répétitifs ne laissent guère de marge d’erreur. Des calculs précis et une manipulation rigoureuse des liquides sont essentiels pour garantir que chaque réaction ait des concentrations et des volumes de réactifs appropriés. La distribution du master mix et l’ajout des matrices peuvent également s’avérer chronophages et physiquement éprouvants, tandis que les interruptions augmentent le risque d’erreurs humaines et de contamination croisée. Ces difficultés s’acentuent à mesure que le nombre d’échantillons augmente, ce qui peut avoir une incidence tant sur le débit que sur la reproductibilité.

L’approche la plus adaptée pour améliorer l’efficacité dépend de la taille des lots et du matériel de laboratoire utilisés dans chaque protocole. Lorsque les débits sont plus élevés, les laboratoires peuvent recourir à des pipettes électroniques multicanaux et à des robots de pipetage. Par ailleurs, des solutions hybrides telles que la SWITCH font le lien entre le pipetage manuel et le pipetage électronique en alliant le confort d’utilisation du contrôle manuel à la distribution répétée. Il est donc essentiel de choisir des outils de manipulation de liquides flexibles, adaptés à votre protocole, à votre matériel de laboratoire et à votre débit, afin de simplifier l’ensemble du processus de PCR, du début à la fin.

N’hésitez pas à nous contacter pour discuter de la solution de manipulation de liquides la mieux adaptée à votre laboratoire et simplifier au maximum vos préparations PCR !