PCR ganz einfach – Strategien für eine unkomplizierte Vorbereitung

Was Sie über die PCR wissen müssen

Die PCR wird in der Molekularbiologie, in der Diagnostik und in Sequenzierungs-Workflows eingesetzt. Diese Technik erlangte während der COVID-19-Pandemie große Bekanntheit, als die Reverse- Transkriptions-PCR (RT-PCR) zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA eingesetzt wurde. Der genaue PCR-Workflow hängt von der Art des Ausgangsmaterials und den aus dem Assay benötigten Informationen ab, beginnt jedoch mit der Zubereitung des Mastermixes. Dazu muss das Volumen jedes Reagenzes berechnet werden, das benötigt wird, um bei jeder Reaktion die richtige Endkonzentration zu erreichen. Anschließend werden Wasser in PCR-Qualität, Desoxynukleotid-Triphosphate (dNTPs), Vorwärts- und Rückwärtsprimer, DNA-Polymerase, Puffer und Magnesiumchlorid in ein einziges Röhrchen pipettiert und gründlich vermischt. Für Arbeitsabläufe im Rahmen der quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wird zudem ein Interkalationsfarbstoff oder eine Fluoreszenzsonde zugefügt, sodass die Amplifikation während des Vorgangs überwacht werden kann. Dieser Mastermix wird anschließend auf PCR-Röhrchen, -Streifen oder -Platten verteilt. Anschließend werden die einzelnen DNA- oder cDNA-Templates hinzugefügt. Denn es ist einfacher, die Probe mit geringem Volumen in eine Flüssigkeit statt in ein leeres Röhrchen zu geben; zudem wird dadurch das Risiko einer Aerosolbildung und einer Kreuzkontamination verringert.

Die vorbereiteten Reaktionen werden anschließend in einen Thermocycler gegeben. Eine Standard-PCR umfasst in der Regel 25 bis 40 Zyklen, wobei sich die Menge der Ziel-DNA theoretisch in jedem Zyklus verdoppelt, sodass Millionen oder sogar Milliarden von Kopien entstehen. Jeder Zyklus beginnt mit der Denaturierung, bei der die doppelsträngige DNA aufgespalten wird, bevor die Temperatur gesenkt wird, damit sich die Primer an die entsprechenden Sequenzen anlagern können, die den Zielbereich flankieren. Während der Extension erstellt die DNA-Polymerase komplementäre Kopien der Zielsequenz.

Die letzte Stufe des Verfahrens hängt von der Art der durchgeführten PCR ab; bei der Endpunkt-PCR werden die amplifizierten Produkte nach dem Thermocycling analysiert, in der Regel mittels Gelelektrophorese, Spektralphotometrie oder Fluorimetrie. Bei der qPCR wird während des gesamten Thermocyclings das Fluoreszenzsignal gemessen. Die Fluoreszenz nimmt im Allgemeinen proportional zur Menge des PCR-Produkts zu, sodass das Gerät einen Zyklusschwellenwert berechnen und die Amplifikation in Echtzeit überwachen kann. Die amplifizierte DNA kann anschließend aufgereinigt werden, um nicht verbrauchte Primer, Nukleotide, Enzyme, Salze und andere Verunreinigungen vor der Sequenzierung oder weiteren Analyse zu entfernen.

Engpässe im Arbeitsablauf (und wie man sie überwindet)

Die PCR ist ein gängiges und unkompliziertes Verfahren, bringt jedoch einige Herausforderungen mit sich.

Mastermix-Zubereitung

Bei der Mastermix-Berechnung müssen die Ausgangs- und Endkonzentrationen, die Reaktionsvolumina und die Probenanzahl berücksichtigt werden. Schon geringfügige Fehler können das Ergebnis beeinflussen. Unterbrechungen bei der Mastermix-Zubereitung können dazu führen, dass Forschende den Überblick darüber verlieren, welche Komponenten bereits hinzugefügt wurden. Dies kann zu falschen Reagenzvolumina oder -konzentrationen führen, wodurch die Amplifikation in Proben oder Positivkontrollen ausbleiben kann. Das manuelle Pipettieren von viskosen oder klebrigen Flüssigkeiten kann ebenfalls eine Herausforderung darstellen, da Materialrückstände in den Pipettenspitzen oder an den Laborgeräten zurückbleiben können. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, für viskose Reagenzien oder solche mit geringer Oberflächenspannung Low-Retention-Pipettenspitzen zu verwenden.

Ein weiteres Problem bei langwierigen Pipettiervorgängen besteht darin, dass wertvolle Reagenzien durch Verdunstung verloren gehen können oder dass temperaturempfindliche Reagenzien an Wirksamkeit verlieren können. Es wird daher empfohlen, PCR-Reagenzien und Proben während des gesamten Vorbereitungsvorgangs kühl zu halten, was das manuelle Liquid-Handling zusätzlich erschwert. Die Komponenten sollten zudem in einer einheitlichen Reihenfolge unter Verwendung eines übersichtlichen Nachverfolgungssystems hinzugefügt werden. Dabei sollte mit  den kostengünstigsten Reagenzien begonnen werden, um den Abfall zu minimieren, falls frühzeitig ein Fehler auftritt. Es wird außerdem empfohlen, für den gesamten PCR-Durchlauf eine einzige Charge Mastermix herzustellen, einschließlich eines zusätzlichen Aliquots, um Verluste auszugleichen. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Reaktionen mit der gleichen Reagenzzusammensetzung stattfinden, wodurch die experimentelle Variabilität verringert wird. Außerdem können dadurch größere Volumina der einzelnen Reagenzien pipettiert werden, was in der Regel die Genauigkeit verbessert. Gleichzeitig reduziert sich die Gesamtzahl der Transfers, wodurch der Arbeitsablauf weniger anstrengend und fehleranfällig wird.

Wiederholte Flüssigkeitstransfers

Das Dispensieren des Mastermixes in die Reaktionsgefäße ist einer der sich am häufigsten wiederholenden Schritte bei der PCR. Das individuelle Befüllen von Röhrchen, Streifen oder Platten mit einer manuellen Einkanalpipette ist zeitaufwendig und birgt die Gefahr, dass Reaktionen übersehen oder doppelt durchgeführt werden. Auch beim Hinzufügen von Proben ist eine präzise Aspiration und Dispensierung kleiner Volumina erforderlich, während das Umfüllen von Proben und Reagenzien zwischen verschiedenen Laborgefäßen das Risiko von Positionierungsfehlern erhöht. Zusammen mit dem wiederholten Laden und Abwerfen der Spitzen macht dies das Vorbereiten einer PCR-Platte sowohl körperlich als auch geistig anstrengend und kann die Wahrscheinlichkeit von Fehlern und Kontaminationen erhöhen.

Manuelle Mehrkanalpipetten wie die leichten, ergonomischen EVOLVE-Pipetten ermöglichen das gleichzeitige Befüllen mehrerer Wells und bieten dabei eine vertraute, intuitive Bedienung. Sie eignen sich besonders für größere Durchläufe, bei denen ausreichend Mastermix zur Verfügung steht, um mit Reagenz-Reservoiren mit geringem Totvolumen zu arbeiten und dadurch Abfall zu minimieren. Alternativ bieten elektronische Pipetten bei wiederholten Transfers eine höhere Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit. Die elektronischen Pipetten VIAFLO bieten einen Mehrfachdispensiermodus sowie weitere programmierbare Betriebsmodi, sodass aus einer einzigen Aspiration mehrere gleichmäßige Aliquote abgegeben werden können. VOYAGER-Pipetten mit einstellbarem Spitzenabstand bieten noch mehr Flexibilität. Sie passen den Abstand zwischen den Pipettenspitzen automatisch an, ermöglichen so einfache Transfers zwischen Röhrchen, Racks und Platten unterschiedlicher Formate und minimieren gleichzeitig Positionierungsfehler.

Bei Workflows mit mittlerem bis hohem Durchsatz ermöglichen die MINI 96, die VIAFLO 96 und die VIAFLO 384 das gleichzeitige Pipettieren einzelner Plattenbereiche oder ganzer Platten, wodurch die Produktivität und Reproduzierbarkeit gesteigert und gleichzeitig der manuelle Arbeitsaufwand reduziert wird. Der Pipettierroboter ASSIST PLUS kann in Kombination mit einer VIAFLO- oder VOYAGER-Pipette oder dem Einkanal-Pipettiermodul D-ONE die Zubereitung und Verteilung von Mastermixen – sowie den Probentransfer – vollständig automatisieren und hilft so, Kontaminationen zu vermeiden und manuelle Arbeitsschritte zu reduzieren.

Verhinderung von Kontamination

Kontamination stellt bei der PCR-Vorbereitung ein erhebliches Problem dar, da bereits winzige Mengen an genetischem Material, die aus der Laborumgebung in die Reaktion gelangen – oder sogar Proben-DNA oder amplifiziertes Produkt aus anderen Wells –, zu fehlerhaften Ergebnissen führen können. Um dies zu verhindern, sollten PCR-Reaktionen in einer dekontaminierten Laminar-Flow-Haube oder einer Sicherheitswerkbank unter Verwendung steriler Filterpipettenspitzen vorbereitet werden. Die Zubereitung des Mastermixes, die Probenvorbereitung, die Amplifikation und die Produktanalyse sollten nach Möglichkeit räumlich voneinander getrennt erfolgen, wobei für jede Aufgabe eigene Pipetten verwendet werden sollten. Es sollte ein unidirektionaler Workflow eingehalten werden, und Geräte dürfen nicht ohne gründliche Dekontamination aus den Post-PCR-Bereichen in die Pre-PCR-Bereiche zurückgebracht werden. Reagenzien aus dem Vorrat sollten ebenfalls in kleinere Aliquote aufgeteilt werden, um zu verhindern, dass der gesamte Vorrat verloren geht, falls ein Aliquot kontaminiert wird.

In der Regel kann eine einzelne Spitze oder ein Satz Spitzen zur Verteilung des Mastermixes verwendet werden, sofern geeignete Maßnahmen zur Kontaminationskontrolle befolgt werden. Dadurch lässt sich der Spitzenverbrauch senken, ohne dass die Gefahr eines Materialtransfers zwischen den Proben besteht. Für jede Probe muss dann eine neue Spitze verwendet werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. In jeden Durchlauf sollten außerdem Positiv- und Negativkontrollen einbezogen werden, um Amplifikationsfehler oder Kontamination frühzeitig zu erkennen. Unser Leitfaden zur Einrichtung eines PCR-Labors enthält weitere Informationen zur Labororganisation und zur Kontaminationskontrolle.

Vereinfachung der PCR-Vorbereitung

Im Labor kommt es oft auf jede Minute an, und bei der PCR ergibt sich die größte Zeitersparnis dadurch, dass wiederholte Aspirationen und Pipettenwechsel entfallen. Bei PCR-Durchläufen mit geringem bis mittlerem Durchsatz möchten Forschende häufig die Präzision einer manuellen Einkanalpipette – für die Mastermix-Zubereitung und die Zugabe der Vorlage – mit Mehrfachdispensierung für eine effiziente Aliquotierung kombinieren. Die Hybridpipette SWITCH vereint beide Funktionen in einem Gerät, sodass Anwendende zwischen manueller Bedienung und elektronischer Mehrfachdispensierung wechseln können, ohne das Gerät wechseln zu müssen. Ein Schnelleinstellring ermöglicht die einhändige Volumenanpassung, und für die Mehrfachdispensierung sind lediglich drei Einstellungen erforderlich, sodass eine komplexe Programmierung entfällt.

Geschwindigkeit und Effizienz

Mit der SWITCH können Anwendende einen Mastermix manuell vorbereiten, in den Mehrfachdispensiermodus wechseln, um ihn auf PCR-Röhrchen, -Streifen oder -Platten zu dispensieren, und anschließend in den manuellen Modus zurückkehren, um einzelne DNA- oder cDNA-Templates hinzuzufügen. Die Dispensierung mehrerer Aliquote aus einer einzigen Aspiration verringert die Gesamtzahl der sich wiederholenden Pipettierschritte und reduziert die mit repetitivem manuellem Pipettieren verbundene Variabilität.

Die SWITCH verwendet GRIPTIPS^®-Pipettenspitzen, die in sterilen und gefilterten Ausführungen erhältlich sind und als frei von RNase, DNase und PCR-Inhibitoren zertifiziert sind. Die Verwendung von gefilterten Spitzen verhindert, dass Aerosole in die Pipette gelangen, und verringert dadurch das Risiko einer Kreuzkontamination. Spitzen mit geringer Retention und großem Innendurchmesser können zudem die Rückgewinnung wertvoller Mastermixe und Proben verbessern. Gleichzeitig erhöhen sie die Pipettiergenauigkeit beim Umgang mit schwierigen Flüssigkeiten.

Verbesserte Ergonomie

Die Reduzierung der Anzahl manueller Pipettiervorgänge bei der PCR-Vorbereitung erhöht nicht nur den Durchsatz, sondern verringert langfristig auch das Risiko von Verletzungen durch wiederholte Belastungen. Die SWITCH erfordert nur einen geringen Kraftaufwand und ihr Kolben bleibt unabhängig von der Volumeneinstellung auf derselben Höhe, wodurch eine übermäßige Dehnung des Daumens vermieden wird. Im Mehrfachdispensiermodus hat der Kolben eine noch geringere Höhe, wodurch der Daumen näher an einer neutralen Position bleiben kann. Alle diese Eigenschaften zusammen machen die SWITCH zu einer komfortableren und ergonomischeren Wahl für PCR-Workflows mit geringerem Durchsatz.

Optimierung der PCR-Aufreinigung

PCR-Produkte können nicht verbrauchte Primer, Nukleotide, Polymerase, Salze und unspezifische Amplifikationsprodukte enthalten, die nachfolgende Applikationen beeinträchtigen. Zu den gängigen Aufreinigungsverfahren zählen Spin-Säulen und magnetische Beads, wie beispielsweise die magnetischen Beads MAGFLO™ NGS für die NGS-Größenselektion und die PCR-Aufreinigung. MAGFLO-Beads entfernen effizient Primerreste, Nukleotide, Enzyme und Salze vor der nachgelagerten Analyse und sorgen so für eine höhere Konsistenz. Sie ermöglichen in der Regel eine Rückgewinnung von mindestens 85 % der Nukleinsäuren und können sowohl in manuellen als auch in automatisierten Workflows mit bis zu 384 Proben eingesetzt werden. Die Beads können mit den MAG- und HEATMAG-Modulen zur Aufreinigung mit magnetischen Beads verwendet werden, die eine automatisierte vertikale magnetische Trennung ermöglichen. Dies gewährleistet ein schnelles Sammeln der Beads bei minimalem Verlust und minimalem Carryover. Zudem werden die Beads an einer Stelle gesammelt, anstatt ein ringförmiges Pellet zu bilden. Dadurch lässt sich der Überstand leichter aspirieren, ohne die Beads dabei zu bewegen. Zudem entfällt das Umsetzen der Platten zwischen der Pipettierposition und einem separaten Magnetständer.. MAG und HEATMAG können mit VIAFLO 96 oder 384 für die Aufreinigung mit hohem Durchsatz verwendet oder automatisiert auf dem ASSIST PLUS eingesetzt werden, wodurch eine vollständig unbeaufsichtigte Aufreinigung mit magnetischen Beads ohne kostspielige Greifer und Roboterarme möglich ist.

Durchgängige Optimierung

Die PCR-Vorbereitung ist anspruchsvoller, als es auf den ersten Blick scheint, da kleine Volumina, wertvolle Reagenzien und wiederholte Transfers kaum Fehler zulassen. Präzise Berechnungen und ein konsistentes Liquid Handling sind unerlässlich, um sicherzustellen, dass bei jeder Reaktion die richtigen Konzentrationen und Volumina der Reagenzien zum Einsatz kommen. Das Dispensieren des Mastermixes und das Hinzufügen der Templates können zudem zeitaufwendig und körperlich anstrengend sein, während Unterbrechungen das Risiko von menschlichen Fehlern und Kreuzkontaminationen erhöhen. Diese Herausforderungen treten mit steigender Probenanzahl immer deutlicher zutage und können sich sowohl auf den Durchsatz als auch auf die Reproduzierbarkeit auswirken.

Welcher Ansatz zur Effizienzsteigerung am besten geeignet ist, hängt von der Chargengröße und der Laborausstattung des jeweiligen Workflows ab. Bei höheren Durchsätzen können Labore auf mehrkanalige elektronische Pipetten und Pipettierroboter zurückgreifen. Alternativ schließen Hybridlösungen wie die SWITCH die Lücke zwischen manuellem und elektronischem Pipettieren, indem sie die Vertrautheit der manuellen Steuerung mit der Mehrfachdispensierung verbinden. Die Auswahl flexibler Werkzeuge für das Liquid Handling, die zu Ihrem Protokoll, Ihrer Laborausstattung und Ihrem Durchsatz passen, ist daher entscheidend, um den gesamten PCR-Workflow von Anfang bis Ende zu vereinfachen.

Nehmen Sie Kontakt mit uns auf, um die für Ihr Labor am besten geeignete Lösung für das Liquid Handling zu besprechen und Ihren Workflow für die PCR-Vorbereitung zu optimieren!