多数のさまざまなHLAタイピング法が使用されていますが、この記事では、これらの方法、ならびにASSIST PLUS自動分注機が、結果の精度と再現性を向上させ、ラボでの作業者の時間を解放するために、どのようにマルチチャネルピペッティングを自動化できるかについて説明します。   

テラサキトレーを使用した血清学的HLAタイピング

HLA血清型を決定するには、抗体を使用してHLA抗原のさまざまな変異体を区別します。HLA特異的抗体のパネルをドナー血清と混和して、免疫反応があるかどうかをテストし、どのHLAパターンが細胞によって発現されているかを特定します。移植前に、最終的な交差適合試験で血清型決定を行うことにより、既存の抗体をスクリーニングして、レシピエントとドナーのHLAを比較することができます。このプロセスでは、患者の血清はドナーのリンパ球と混和されます。

どちらの用途でも、テラサキトレーと呼ばれる特殊なプレートが使用されます。トレーは60ウェルまたは72ウェルを有し、ウェルあたりの容量は約10 µlで、トレーに分注されたサンプルの蒸発を防ぐために鉱油が使用されます。このような少量のサンプルを各ウェルの中央のオイルに正確に分注することは難しく、経験豊かなラボ技術者でも問題が発生する可能性があります。VOYAGERチップ間隔可変電動ピペットをASSIST PLUSに装着して使用すれば、独自の寸法を有するテラサキトレーを使用する場合でも、このプロセスを自動化することができます。自動化により、毎回ピペットチップの正確な位置決めが保証され、一定の高さと速度で正確かつ精度よく少量のサンプルを分注することができます。効率を最大限に引き出すために、INTEGRAはこのアプリケーション用に特別に設計されたアダプターを提供し、作業者が最大2枚のテラサキプレートを連続して処理できるようにすることでスループットとウォークアウェイ時間を向上させます。

ELISAベースおよびLuminex®HLAタイピング

血清型の決定は、ドナーのHLAとレシピエントの抗体の間の反応性を決定するELISA法によっても実行できます。標準的ELISA法と比較して、Luminexテクノロジーはビーズベースのイムノアッセイシステムであり、最大100の分析物を同時に検出できるため、HLAテストの感度と特異性が高くなります。したがって、世界的に固形臓器移植におけるドナー特異的HLA特異的抗体を同定するための臨床標準となっています。

ELISA法およびLuminexアッセイは、マルチウェルマイクロプレートベースのアッセイであり、通常は96ウェルプレートで実行されますが、これはVIAFLOマルチチャネル電動ピペットで効率的に処理できます。ピペットをASSIST PLUSに装着することにより、ELISAステップを自動化して、忙しい臨床検査室での貴重な時間から解放され、技術者間の結果のばらつきを最小限に抑えることができます。イムノアッセイの面倒な分注手順（プレートのコーティング、サンプルの移動、検出抗体の追加、反応の停止）はすべて、ASSIST PLUS自動分注機によって簡単に自動化できます。これについて詳細に説明しているアプリケーションノートは、こちらから閲覧できます。

分子HLAタイピング

血清学的に区別できないHLA変異体が存在することが明らかになったことから、臨床分子タイピング法が開発されましたが、この検査では基礎となる遺伝子のみを調べます。PCR配列特異的プライマー（PCR-SSP）、PCR配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（PCR-SSOP）、PCR配列ベースのタイピング（PCR-SBT）、および次世代シーケンシング（NGS）など、多くの配列ベースのHLAタイピングプロトコルが使用されています。すべての分子HLAタイピング法は、サンプルから核酸を分離することから始まり、次にPCRを使用して、完全なHLA領域、完全長の遺伝子、または特定のHLAエクソンのいずれかである対象の標的領域を増幅します。HLAシステムは3,600キロベースに及ぶ大きな遺伝子複合体であるため、1つのサンプルをタイピングするには複数のPCR反応が必要です。

INTEGRA は、ASSIST PLUS自動分注機を使用した サンプルの核酸抽出に最適なシステムを提供します。また、 分子HLAのPCRセットアップを自動化することもできます。これにより、ハンズオンタイムが大幅に短縮され、サンプルあたりの全体的なコストが削減されます。384ウェルプレートでのPCRセットアップも簡単に自動化できるため、多数のサンプルを効率的にタイピングできます。ASSIST PLUSを使用してVOYAGERチップ間隔可変電動ピペットを自動化することにより、複数のチャネルを並行して使用してチューブに保存されたサンプルをプレートに追加でき、正確かつ精度よく少量のサンプルを処理できます。さらに、このセットアップを、SureFlo™アンチシーリングアレイによりデッドボリュームが最小となるように設計されたINTEGRAマルチチャネル試薬リザーバーと組み合わせると、高価な試薬の消費を最小限に抑えることができます。必要に応じて、リザーバー用のアダプターと96ウェルまたは384ウェルのPCRプレート冷却を使用することにより、アッセイの準備中にサンプルが低温で保たれるようにすることができます。 

SBTおよびNGS法の場合、通常は増幅産物の定量および精製は、PCR手順の後に磁気ビーズ精製によって実行する必要があります。磁気プレートに対応するASSIST PLUSの柔軟なデッキセットアップにより、精製中の面倒な分注ステップを自動化できます。サンプルの回収率は、チップの高さ、分注速度、チップ角度などの最適な分注設定によって最大化されます。これにより、サンプルウェル内のチップの一貫した配置が保証され、ビーズの妨害やビーズのキャリーオーバーを妨げるリスクが最小限に抑えられるため、下流のシーケンス分析に高いサンプル収量と純度が提供されます。

終わりに

HLAタイピングにおける人的ミスまたは不正確な液体処理は、患者とドナーが一致しない場合、深刻な結果につながる可能性があります。ワークフローを自動化することにより、これらのリスクを最小限に抑えることができます。ASSIST PLUS自動分注機を使用すると、手動ワークフローと比較して、より高い精度と再現性で少量のサンプルを分注できます。これは、サンプルが小さくて貴重な場合に特に重要です。ASSIST PLUSをINTEGRAの25種類の電動マルチチャネルピペットの1つと組み合わせることにより、さまざまな容量と数の分注チャネルが提供されます。1つのHLAタイピング法に制限されることなく、ワークフローの必要性に応じてさまざまなプロセスとアプリケーションを簡単に切り替えることができます。VOYAGERチップ間隔可変電動ピペットをASSIST PLUSに装着して自動化することにより、テラサキトレーやチューブラックでも処理でき、生産性が向上します。これにより、ASSIST PLUSはHLAタイピングにおける検出力の強化を求める診断ラボや輸血および移植センター向けの多目的ツールとして機能します。