scRNA-seq ist eine bahnbrechende Technik. Forschende können damit die Heterogenität von Zellen untersuchen, seltene Zellpopulationen identifizieren und Koexpressionsmuster von Genen untersuchen. Sie hat entscheidend dazu beigetragen, unser Wissen über komplexe biologische Prozesse zu erweitern und neue Therapien zu entwickeln, beispielsweise in den Bereichen Neurologie, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs, und hat sich in der kurzen Zeit seit ihrer ersten Verwendung im Jahr 2009 rasch weiterentwickelt.1 Third generation scRNA-seq mit kombinatorischer Barcodierung ist für die medizinische Forschung von enormem Wert, weil damit zelluläre Reaktionen auf medikamentöse Behandlungen untersucht werden können. Außerdem lassen sich die genetischen Mechanismen dahinter verstehen und die Wirksamkeit von Stammzelltherapien in verschiedenen Krankheitsbereichen bestimmen. Zudem wird damit ein zuvor unerreichter Durchsatz ermöglicht, da die physische Zellpartitionierung – und die damit verbundene teure Ausrüstung – entfällt, die für frühere scRNA-seq-Iterationen erforderlich war.

Revolutionierung der Einzelzellsequenzierung 

Parse Biosciences mit Sitz in Seattle im US-Bundesstaat Washington ist auf die Entwicklung bahnbrechender Tools für Third generation scRNA-seq in großem Maßstab spezialisiert. Die vom Unternehmen selbst entwickelte Evercode™-Technologie für kombinatorische Barcodierung markiert Moleküle mit zellspezifischen Barcode-Kombinationen und ermöglicht so die Erweiterung von Projekten, ohne dass eine Zellisolierung erforderlich ist. Der Evercode-scRNA-seq-Arbeitsablauf besteht aus drei Abschnitten: kombinatorische mehrstufige Barcodierung einzelner Zellen, Amplifikation von barcodierter cDNA und schließlich Erstellung von Bibliotheken für die Sequenzierung. Im ersten Abschnitt werden die Zellen fixiert und permeabilisiert, sodass jede einzelne Zelle zu einer eigenen Reaktionskammer wird und keine einzelnen Zellen in Tröpfchen oder Mikrovertiefungen fixiert werden müssen. Das Split-Pool-Barcodierungsverfahren kennzeichnet die Zellen dann mit einer großen Anzahl von Barcode-Kombinationen.

Mit der Evercode-Technologie können bis zu 1 Million Zellen und 96 biologische Proben parallel verarbeitet werden. Die Zellen können bis zu sechs Monate lang entnommen, fixiert und gelagert werden, sodass die an verschiedenen Tagen entnommenen Proben zusammen verarbeitet werden können, etwa in Zeitverlaufsstudien oder zur Vermeidung von Chargeneffekten. Die Gen- und Transkriptdetektionstechnologie von Evercode hat sich dank ihrer hohen Empfindlichkeit in großem Maßstab als leistungsfähiger erwiesen als tröpfchenbasierte Methoden. Die Technik liefert auch qualitativ hochwertige Daten, die mit der Trailmaker™ End-to-End-Datenanalysesoftware von Parse Biosciences analysiert werden können, die zusammen mit dem Sequenzierkit bereitgestellt wird.

Dr. Charlie Roco, Mitbegründer und CTO von Parse Biosciences, hob die Bedeutung der Automatisierung für diese fortschrittliche scRNA-seq-Technik hervor: „Die Einführung der kombinatorischen Barcodierung für die RNA-Sequenzierung war aus mehreren Gründen nur eingeschränkt möglich. Beispielsweise sind viele der derzeit auf dem Markt befindlichen Sequenzierungs- und Automatisierungsinstrumente für kleinere Einrichtungen mit knappen Budgets unerschwinglich, und es kann Monate dauern, sie einzurichten und das Personal vollständig in ihre Bedienung einzuweisen. Der Mangel an nutzerfreundlichen und unkomplizierten Plattformen zu einem realistischen Preis ist ein Hindernis für die Einführung von scRNA-seq. Dies zeigt den Bedarf für eine leichter zugängliche Lösung, um eine breitere Akzeptanz zu fördern.“

Integration der Automatisierung für optimierte Barcodierung

Parse Biosciences wandte sich Ende 2023 mit dem Vorhaben an INTEGRA, gemeinsam eine automatisierte scRNA-seq-Lösung zu entwickeln, die dazu beitragen würde, einige der Hindernisse auszuräumen, die einem schnelleren Fortschritt in der Praxis entgegenstehen. Im Zuge der erfolgreichen Zusammenarbeit mit INTEGRA wurde nun die erste der drei Evercode-Workflow-Phasen auf dem ASSIST PLUS-Pipettierroboter automatisiert, wobei das Einkanal-Pipettiermodul D ONE und eine federleichte elektronische Achtkanal-Pipette vom Typ VIAFLO zum Einsatz kamen. Die Entwicklung und Überprüfung dieses bahnbrechenden Protokolls dauerte nur wenige Monate. Das Automatisierungspaket kam Anfang Mai 2024 auf den Markt. Der mit dem D-ONE-Pipettiermodul ausgestattete ASSIST PLUS fügt den intrazellulären Transkripten wellspezifische Barcodes hinzu, bereitet Reagenzienmischungen vor und gibt die Zellen in die Barcode-Etikettierplatten des Evercode-Kits ab, was die Unterscheidung einzelner Zellen ermöglicht. Diese nahtlose Integration trägt zur Verringerung von menschlichen Fehlern sowie der Variabilität zwischen Bedienern bei und ermöglicht es den Anwendern, den Durchsatz ihres Labors zu erhöhen, indem sie problemlos Hunderte einzelner Proben in nur einer Woche sequenzieren können.

Charlie Roco weiter: „Dieses einfach zu bedienende, kostengünstige und leistungsstarke Liquid-Handling-Setup hat die automatisierte scRNA-seq-Probenvorbereitung für Labore aller Größen und Budgets weitaus effizienter und zugänglicher gemacht, sei es für akademische Gruppen, Genomics Core Facilities oder auch Pharmaunternehmen. Obwohl die Entwicklung noch in den Kinderschuhen steckt, berichten uns unsere Kunden bereits, wie die Liquid-Handling-Automatisierung ihre Sequenzierungsprozesse für einen schnelleren Durchsatz immens beschleunigt hat. Darüber hinaus fällt damit die scRNA-seq-Standardisierung leichter, da die Fehlerzahl sinkt und Ergebnisse leichter reproduzierbar werden. Tatsächlich zeigen unsere bisherigen Daten, dass Labore ihre Arbeitszeit um bis zu 75 Prozent reduzieren und bis zu 85 Prozent ihrer manuellen Pipettierschritte einsparen konnten. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass hochqualifiziertes Personal für andere wichtige Aufgaben und neue scRNA-seq-Forschungsprojekte frei wird.“

„Wir sind gerade dabei, die verbleibenden zwei Abschnitte unseres scRNA-seq-Protokolls auf dem ASSIST PLUS zu automatisieren, und erwarten, dass wir diese aktualisierte Lösung in naher Zukunft unseren Kunden zur Verfügung stellen können. Wir freuen uns sehr, unsere erfolgreiche Zusammenarbeit mit INTEGRA fortzusetzen und in den kommenden Monaten und Jahren einen Beitrag zu diesem sich schnell entwickelnden Forschungsgebiet zu leisten“, so Charlie Roco abschließend.

More information: Product sheet Parse and INTEGRA single cell automation bundle

Quelle

1. Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 2009; 6(5): 377–382. doi: 10.1038/nmeth.1315