Il existe plusieurs méthodes de typage HLA ; cet article présente comment le robot de pipetage ASSIST PLUS peut automatiser le pipetage multicanaux pour améliorer l’exactitude et la reproductibilité des résultats, tout en faisant gagner du temps au personnel du laboratoire.  

Sérotypages HLA dans une plaque de Terasaki

Dans le sérotypage HLA, on utilise des anticorps pour faire une distinction entre les différents variants des antigènes HLA. Un groupe d’anticorps spécifiques de HLA est mélangé au sérum du donneur pour tester la présence d’une éventuelle réaction immunologique et identifier quels modèles HLA sont exprimés par les cellules. Avant la transplantation, le sérotypage avec croisement final permet de dépister les anticorps préexistants pour comparer les HLA du receveur et du donneur. Dans ce processus, on mélange du sérum du patient à des lymphocytes du donneur.

Dans les deux applications, on utilise une plaque spéciale – nommée plaque de Terasaki –. Elle contient 60 ou 72 puits d’une capacité d’env. 10 µl chacun et de l'huile minérale est utilisée pour prévenir l’évaporation des échantillons distribués dans la plaque. Pipeter précisément ces faibles volumes dans l’huile au centre de chaque puits est une tâche délicate qui peut causer des difficultés aux techniciens de laboratoire les plus expérimentés. La pipette à écartement réglable des pointes VOYAGER peut-être associée à ASSIST PLUS pour automatiser cette opération et ce, malgré les dimensions particulières des plaques de Terasaki. L’automatisation garantit à chaque fois le positionnement exact de la pointe de pipette, permettant la distribution précise et exacte de petits volumes à des profondeurs d’immersion et des vitesses homogènes. Pour une efficacité maximale, INTEGRA propose un adaptateur spécifiquement conçu pour cette application, permettant aux utilisateurs de traiter jusqu’à deux plaques de Terasaki d’affilée, pour un meilleur débit et plus de temps mains libres.

Typage HLA par ELISA et Luminex®

Le sérotypage peut également être effectué par ELISA pour déterminer la réactivité entre les HLA du donneur et les anticorps du receveur. Par rapport aux ELISA standards, la technologie Luminex est un système d’immunodosage à base de microbilles qui permet de détecter simultanément jusqu’à 100 analytes, avec une sensibilité et une spécificité plus élevées pour les typages HLA. Elle est d’ailleurs devenue la norme clinique internationale pour l’identification d’anticorps HLA spécifiques du donneur dans les transplantations d’organes pleins.

Les tests ELISA et Luminex utilisent des microplaques multipuits – ils sont généralement effectués dans des plaques de 96 puits – et peuvent être réalisés de façon efficace avec les pipettes électroniques multicanaux VIAFLO. Fixer la pipette sur l'ASSIST PLUS permet d’automatiser les étapes ELISA, libérant un temps précieux dans un laboratoire clinique au rythme de travail soutenu et minimisant les variations des résultats entre opérateurs. Toutes les étapes fastidieuses de pipetage de l'immunoessai – revêtement de la plaque, transfert des échantillons, ajout de l’anticorps de détection et arrêt de la réaction – sont facilement automatisées avec le robot de pipetage ASSIST PLUS. Une note d’application détaillée sur le sujet est disponible ici.

Typage HLA par biologie moléculaire

Les stratégies de typage moléculaire clinique ont été développées lorsqu'on a constaté que certains variants HLA ne pouvaient être différenciés par la voie sérologique, mais uniquement par l’analyse des gènes sous-jacents. Il existe plusieurs protocoles de typage par séquençage, dont les PCR-SSP (sequence-specific primer ou amorce spécifique de séquence), les PCR-SSOP (sequence-specific oligonucleotide probe ou sonde d'oligonucléotides spécifiques d'une séquence), PCR-SBT (sequence-based typing ou séquençage de type Sanger) et le séquençage de nouvelle génération ou séquençage haut débit (NGS). Toutes ces méthodes commencent par la séparation des acides nucléiques de l’échantillon, puis utilisent la PCR pour amplifier la zone d’intérêt cible – la zone HLA entière, des gènes pleine longueur ou certains exons d’HLA. Le système HLA étant un vaste complexe génétique de 3600 kilobases, plusieurs réactions PCR sont nécessaires pour permettre le typage d’un échantillon.

INTEGRA propose, avec le robot de pipetage ASSIST PLUS, un système optimal pour l’extraction d’acides nucléiques des échantillons, qui peut également permettre d’automatiser la préparation de la PCR  pour le typage HLA par voie moléculaire, réduisant ainsi de manière significative le temps de manipulation et le coût global par échantillon. Il est possible de réaliser le typage efficace d’un très grand nombre d’échantillons, la préparation de PCR en plaques 384 puits pouvant être elle-aussi très simplement automatisée. En automatisant la pipette à écartement réglable des pointes VOYAGER avec l'ASSIST PLUS, les échantillons stockés dans des tubes peuvent être ajoutés aux plaques en utilisant plusieurs canaux en parallèle, garantissant ainsi une manipulation exacte et précise des faibles volumes. De plus, intégrer les réservoirs à réactifs multicanaux d’INTEGRA à cette configuration minimise la consommation de coûteux réactifs, le réservoir SureFlo™ offrant, grâce à sa structure anti-ventouse, le volume mort le plus faible du marché. Le cas échéant, les utilisateurs peuvent s’assurer que les échantillons restent frais durant la préparation de l’essai en utilisant des adaptateurs pour le refroidissement des réservoirs et des plaques PCR 96 ou 384 puits. 

Pour les méthodes SBT et NGS, la quantification et la purification des amplicons doivent être effectuées après les étapes de PCR, généralement par purification à base de billes magnétiques. La configuration flexible de la plateforme de l'ASSIST PLUS permet aux utilisateurs d’utiliser des plaques magnétiques afin d’automatiser les étapes fastidieuses de pipetage pendant la purification. La récupération des échantillons est maximisée grâce à des paramétrages de pipetage optimaux, notamment la profondeur d’immersion de la pointe, les vitesses de pipetage et l’angle de la pointe. Cela garantit un positionnement constant de la pointe dans le puits de l’échantillon, ce qui minimise le risque de perturbation des billes ou de transfert des billes, afin d'obtenir des échantillons aux niveaux de rendement et de pureté élevés pour les analyses séquentielles en aval.

Conclusions

Les erreurs humaines ou les manipulations de liquides inadéquates lors du typage HLA peuvent avoir de graves conséquences si les patients et les donneurs ne sont pas compatibles. Automatiser le processus peut minimiser ces risques. L’utilisation du robot de pipetage ASSIST PLUS génère un pipetage des faibles volumes plus exact et plus précis qu’avec un processus manuel, ce qui est particulièrement important lorsque les échantillons sont de petite taille et très précieux. En combinant ASSIST PLUS à l’une des 25 pipettes électroniques multicanaux d’INTEGRA, disponibles dans plusieurs volumes et canaux de pipetage, vous n’êtes pas limité à une unique méthode de typage HLA et pouvez facilement basculer d’un processus ou d’une application à l’autre, selon les besoins de votre travail. Automatiser la pipette à écartement réglable des pointes VOYAGER sur ASSIST PLUS permet même de traiter des plaques de Terasaki ou des racks de tubes, pour davantage de productivité. Cela fait de l'ASSIST PLUS un outil polyvalent pour les laboratoires de diagnostic et les centres de transfusion et de transplantation.