La purification PCR est essentielle pour éliminer les composés indésirables qui pourraient interférer avec les applications en aval, en veillant à ce que seuls les amplicons d’intérêt soient conservés. Pour ce faire, les méthodes de purification PCR par billes magnétiques ou par colonne de nettoyage sont généralement utilisées. Nous proposons des solutions pour les deux approches, mais nous recommandons la purification PCR avec des billes magnétiques, car ces protocoles sont facilement automatisés, ce qui permet de gagner un temps précieux tout en réduisant les erreurs et en augmentant la reproductibilité de vos résultats.

Comment fonctionne la purification par billes magnétiques ?

La purification PCR à l’aide de billes magnétiques est un processus en trois étapes comprenant la liaison, le lavage et l’élution. Les étapes de manipulation des liquides peuvent être automatisées sur des plateformes de paillasse, ce qui élimine les étapes fastidieuses de centrifugation et de mise sous vide associées aux protocoles de colonnes de nettoyage. Cela permet d’améliorer la reproductibilité du processus, d’augmenter le débit et de gagner du temps.

Étape 1 : liaison

Dans un premier temps, des billes magnétiques sont ajoutées à l’échantillon selon un rapport billes/échantillon précis, généralement 1,8x, afin d’éliminer efficacement les fragments d’ADN <100 pb. Cette étape est suivie de cycles de mélange et d’incubation pour faciliter la liaison des amplicons d’ADN aux billes. La séparation magnétique est ensuite utilisée pour collecter les amplicons liés aux billes, ce qui permet au surnageant – contenant des fragments d’ADN plus petits tels que les amorces et les dimères d’amorces – d’être facilement aspiré et jeté, isolant ainsi les acides nucléiques.

Étape 2 : lavage

Les autres composants indésirables – dNTP non incorporés, enzymes et sels – sont éliminés en ajoutant de l’éthanol à l’échantillon, en mélangeant et en répétant la séparation magnétique. L’éthanol contenant les composants indésirables est aspiré et jeté, et une étape de séchage à l’air assure l’évaporation complète du solvant résiduel pour éviter toute interférence avec les applications en aval.

Étape 3 : élution

Enfin, un tampon d’élution à faible teneur en sel ou de l’eau exempte de nucléase est ajouté pour remettre en suspension les billes séchées et libérer l’ADN lié – les amplicons – dans la solution. La séparation magnétique est ensuite utilisée pour isoler les billes de l’éluat, ce qui permet de recueillir de l’ADN purifié de haute qualité pour les applications en aval.

Comment rationaliser vos protocoles de purification PCR sur billes magnétiques ?

Nous proposons un certain nombre de solutions pour optimiser au maximum les processus en laboratoire et améliorer l’efficacité des flux de travail de purification PCR sur billes magnétiques.

• Billes magnétiques MAGFLO™ NGS pour la sélection de taille NGS et pour la purification PCR* – Les billes magnétiques MAGFLO NGS offrent des taux de récupération élevés des amplicons. Vous pouvez commander un échantillon gratuit de 1 ml pour les essayer par vous-même.
• Module MAG – notre module magnétique est une alternative utile aux supports magnétiques traditionnels. Grâce aux mouvements verticaux automatisés des aimants, il n’est plus nécessaire de transférer les tubes et les plaques vers et depuis les supports magnétiques, ce qui élimine le risque de déversement. De plus, les billes sont rassemblées en un seul point, plutôt que de former un culot en forme d’anneau, ce qui facilite l’aspiration des surnageants sans les perturber. Une variété d’adaptateurs est disponible pour différents types de matériel de laboratoire, permettant un ajustement parfait entre les cuves d’échantillons et les aimants afin de s’assurer que toutes les billes sont capturées et de garantir des rendements élevés. Pour améliorer encore votre productivité, le module MAG peut être associé à nos plateformes de paillasse – les pipettes électroniques à commande manuelle VIAFLO 96 et VIAFLO 384 et le robot de pipetage ASSIST PLUS – pour des flux de travail semi-automatiques ou entièrement automatisés.
• Robot de pipetage ASSIST PLUS – l’ASSIST PLUS permet l’automatisation de nos pipettes électroniques multicanaux et l’intégration du module MAG pour offrir des flux de purification PCR entièrement automatisés. Contrairement aux robots de manipulation de liquides plus grands, cette solution abordable peut être mise en place sans aucune connaissance préalable en matière de programmation. INTEGRA fournit également des modèles de scripts pour vous faciliter la tâche.
• Pipettes électroniques à commande manuelle VIAFLO 96 et VIAFLO 384 – semi-automatisez vos transferts de liquides avec nos pipettes VIAFLO 96 et VIAFLO 384, qui permettent le pipetage simultané de 96 ou 384 échantillons. Combinées avec un module MAG, elles sont idéales pour les flux de travail de purification de billes magnétiques à haut débit et sur plaque complète. Notre note d’application, Des délais d’attente des résultats fiables avec un protocole de purification PCR à haut débit utilisant des billes magnétiques vous explique tout ce qu’il faut savoir.  

Comment fonctionne la purification par colonne de nettoyage ?

La purification PCR à l’aide de colonnes de nettoyage consiste en plusieurs étapes : liaison, lavage et élution, à l’instar des flux de travail basés sur les billes magnétiques. Les colonnes de nettoyage contiennent une membrane ayant une affinité pour les acides nucléiques et sont insérées dans des tubes de microcentrifugation. Les échantillons sont transférés dans la colonne de nettoyage et centrifugés pour isoler les amplicons d’ADN d’une taille spécifique. Ceux-ci se lient à la membrane, tandis que la plupart des composants indésirables – y compris les amorces et les dimères d’amorces – passent à travers. Tout composant indésirable restant peut être éliminé en ajoutant un tampon de lavage à la colonne de nettoyage, suivi d’une centrifugation. Enfin, le tampon d’élution est ajouté et la colonne est à nouveau centrifugée pour libérer de la membrane les amplicons d’ADN purifiés.

Les colonnes de nettoyage sont disponibles sous forme de colonnes individuelles ou de plaques à membrane de silice à 96 puits qui peuvent être placées sur un collecteur à vide au lieu d’être centrifugées, ce qui vous permet d’adapter le flux de travail pour un débit plus élevé. Cependant, la méthode de la colonne de nettoyage présente certains inconvénients par rapport à la purification à base de billes magnétiques. Les membranes peuvent se bloquer facilement et le volume d’élution minimal est plus important, ce qui se traduit par des concentrations d’ADN plus faibles. Le flux de travail comprend également plusieurs étapes pratiques avec une centrifugeuse ou un collecteur à vide, qui sont difficiles à automatiser, ce qui augmente le risque d’erreurs humaines.

Comment rationaliser vos protocoles de purification PCR sur colonne de nettoyage ?

Un certain nombre de nos solutions de manipulation des liquides peuvent être utilisées pour rationaliser les flux de travail de vos colonnes de nettoyage :

• Pipettes à écartement automatique des pointes VOYAGER – Les pipettes VOYAGER peuvent ajuster automatiquement l’espacement des pointes en appuyant simplement sur un bouton, ce qui vous permet de transférer facilement des tampons des réservoirs aux colonnes de nettoyage ou aux plaques à membrane de silice, éliminant ainsi la nécessité de travailler avec des pipettes monocanal.
• VIAFLO 96 et VIAFLO 384 – ces pipettes à 96 et 384 canaux permettent le pipetage en parallèle de tampons dans les 96 puits d’une plaque à membrane de silice, réduisant ainsi le temps de manipulation. Lire notre note d’application Purification de produits PCR avec le kit de purification PCR QIAquick® 96 et la pipette électronique à commande manuelle VIAFLO 96 pour découvrir les avantages offerts par ces pipettes.

Découvrez nos solutions pour améliorer vos applications de purification d’acides nucléiques.

*Les billes magnétiques MAGFLO NGS sont uniquement disponibles en Autriche, en Belgique, au Danemark, en France, en Allemagne, en Irlande, aux Pays-Bas, en Suède, en Suisse et au Royaume-Uni.