Schritt 1: Probenvorbereitung: Aliquotierung und Nukleinsäure-Extraktion

Aliquotierung/Reformatierung

Verschiedene Probentypen, z. B. Blut oder Gewebe, werden in Primärröhrchen gesammelt. Bei der Aliquotierung oder Reformatierung wird ein Teil jeder Probe aus den Primärröhrchen in ein Format übertragen, das für die Nukleinsäure-Extraktion oder die Langzeitlagerung geeignet ist.

Unsere Lösungen: Wir empfehlen die Verwendung des ASSIST PLUS-Pipettierroboters, um eine VOYAGER-Pipette mit einstellbarem Spitzenabstand für diesen Schritt zu automatisieren. Der ASSIST PLUS beschleunigt die Abläufe in Ihrem Labor, indem er routinemäßige Pipettieraufgaben automatisiert. Der Pipettierroboter ist eine vielseitige Plattform, die alle unsere elektronischen Mehrkanalpipetten VOYAGER und VIAFLO sowie das Einkanal-Pipettiermodul D-ONE automatisieren kann.

Lesen Sie unseren Anwendungshinweis mit gebrauchsfertigen Skripten, um mehr darüber zu erfahren, wie der ASSIST PLUS dazu verwendet werden kann, Proben von Röhrchen auf Platten zu übertragen.

Wenn Sie einen manuellen Arbeitsablauf bevorzugen, kann die VOYAGER-Pipette auch ohne den ASSIST PLUS verwendet werden. Der auf Knopfdruck einstellbare Spitzenabstand steigert die Produktivität, da Sie mehrere Proben gleichzeitig zwischen Laborgefäßen verschiedener Formate übertragen können.

Nukleinsäure-Extraktion

Nukleinsäuren können mit verschiedenen Methoden extrahiert werden, u. a. mit magnetischen Beads. Anschließend wird die extrahierte DNA und/oder RNA zunächst einer Qualitätskontrolle unterzogen, um die Anforderungen an die Bibliotheksvorbereitung zu erfüllen. Qualitätsbewertungen können Konzentrationsmessungen mittels Fluoreszenz und Gelelektrophorese-Techniken zur Überprüfung der Integrität und Messungen der optischen Dichte umfassen, mit denen sich Verunreinigungen nachweisen lassen (A260/A280- und A260/A230-Verhältnisse).

Unsere Lösungen: Wenn Sie mit magnetischen Beads für die Nukleinsäure-Extraktion arbeiten, empfehlen wir die Verwendung von MAG- oder HEATMAG-Modulen in Kombination mit dem ASSIST PLUS-Pipettierroboter oder den elektronischen Handpipetten VIAFLO 96 und VIAFLO 384. Dies ermöglicht halb- oder vollautomatische Arbeitsabläufe mit magnetischen Beads, die manuelle Fehler ausschließen und die Produktivität und Reproduzierbarkeit optimieren. Die MAG- und HEATMAG-Module verfügen über starke Magnete, die sich automatisch auf und ab bewegen, um die Beads schnell und präzise zu sammeln. Darüber hinaus bietet das HEATMAG-Modul ein integriertes Heizelement für ein kontrolliertes Aufheizen auf bis zu 65 °C, was die Effizienz der Lyse und Elution erhöhen kann, um die Ausbeute zu maximieren.

Schritt 2: Bibliotheksvorbereitung: Aufbereitung von Nukleinsäuren für die Sequenzierung

Bei der Bibliotheksvorbereitung werden die extrahierten DNA- oder RNA-Fragmente in ein Format umgewandelt, das für die Sequenzierung geeignet ist. Ein genaues Liquid-Handling ist in diesem Schritt entscheidend, um Konsistenz und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, insbesondere bei der Größenselektion auf Bead-Basis, um DNA-Fragmente in der richtigen Größe zu erhalten.

Die NGS-Bibliotheksvorbereitung umfasst in der Regel drei Hauptschritte:

– Fragmentierung: Die DNA wird mit physikalischen (z. B. Schallwellen) oder enzymatischen (z. B. unspezifische Endonuklease) Methoden fragmentiert, um kleinere, handhabbare Stücke zu erzeugen, die für die Sequenzierung geeignet sind.
– Erstellung von NGS-Bibliotheken: Es werden für die NGS-Plattform spezifische Adapter hinzugefügt und während der PCR können Indizes (Barcodes) für das Multiplexing eingefügt werden.
– Größenselektion/Aufreinigung: Die mittels PCR erzeugte Bibliothek wird aufgereinigt, um unerwünschte Komponenten wie Primer, Primer-Dimere, Salze und Polymerasen zu entfernen und eine saubere, sequenzierfähige Probe zu erhalten. Die Größenselektion kann auch verwendet werden, um die gewünschte DNA-Fragmentgröße für die Sequenzierung zu isolieren.

Automatisierte Systeme erhöhen die Genauigkeit, minimieren menschliche Fehler und verbessern die Präzision und Zuverlässigkeit von Sequenzierungsdaten. Gleichzeitig tragen sie dazu bei, Arbeitsabläufe zu rationalisieren.

Unsere Lösungen: Das MIRO CANVAS ist eine Mikrofluidik-Plattform, die eine vollständige Automatisierung von Protokollen zur NGS-Bibliotheksvorbereitung ermöglicht. Das System kann enzymatische Fragmentierung, PCR-Schritte und die Aufreinigung mit magnetischen Beads in einem einzigen Durchgang durchführen.

Lesen Sie in unseren Anwendungshinweisen, wie das MIRO CANVAS eingesetzt werden kann, um Protokolle zur NGS-Bibliotheksvorbereitung zu automatisieren.

Alternativ können Sie die MAG- oder HEATMAG-Module mit unseren Benchtop-Liquid-Handling-Plattformen ASSIST PLUS, VIAFLO 96 oder VIAFLO 384 kombinieren, um Arbeitsabläufe mit magnetischen Beads zu implementieren.

Lesen Sie unseren Anwendungshinweis mit gebrauchsfertigen Skripten, um mehr darüber zu erfahren, wie der ASSIST PLUS eingesetzt werden kann, um Arbeitsabläufe zur NGS-Größenselektion zu automatisieren.

Schritt 3: Qualitätskontrolle: Quantifizierung, Normalisierung und Pooling

Die Qualitätskontrolle stellt sicher, dass die Bibliothek korrekt vorbereitet wird, wodurch Fehler reduziert, die Datengenauigkeit verbessert und zuverlässige Sequenzierungsergebnisse erzielt werden. Die Kontrolle kann in drei Schritte unterteilt werden:

– Quantifizierung: Messung der DNA-Konzentration in der Bibliothek, um sicherzustellen, dass die richtige Menge an Material in den Sequenzer geladen wird.
– Normalisierung: Anpassung der Probenkonzentrationen an ein einheitliches Niveau, um sicherzustellen, dass jede Probe bei der Sequenzierung gleichmäßig vertreten ist.
– Pooling: Kombination von normalisierten Proben zu gleichen Teilen, um eine ausgewogene Verteilung zu gewährleisten und gleichzeitig die Sequenzierungseffizienz sowie den Durchsatz zu maximieren.

Unsere Lösung: Die Pipettierschritte der Quantifizierung, Normalisierung und des Poolings können mit einem ASSIST PLUS-Pipettierroboter in Kombination mit einem D-ONE-Modul automatisiert werden. Diese Lösung ermöglicht eine mühelose und automatisierte Verarbeitung komplexer Liquid-Handling-Aufgaben dank spezieller Softwarebefehle für die einfache Erstellung von Arbeitslisten und die Durchführung von Pipettierschritten.

Lesen Sie in unserem Anwendungshinweis mit gebrauchsfertigen Skripten, wie der ASSIST PLUS eingesetzt werden kann, um Arbeitsabläufe zur DNA-Normalisierung zu automatisieren.

Schritt 4: Sequenzierung

NGS kann mit einer Vielzahl verschiedener Technologien von Unternehmen wie Illumina, Oxford Nanopore und PacBio durchgeführt werden. Lesen Sie unseren Blogbeitrag zu DNA-Sequenzierungsmethoden, um zu erfahren, wie die verschiedenen Techniken funktionieren, und werfen Sie einen Blick auf unseren Blogbeitrag zum Thema Sanger-Sequenzierung vs. NGS, um mehr über die jeweiligen Vor- und Nachteile zu erfahren.