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当社のリキッドハンドリングソリューションはNGSワークフローをいかに効率化させるか
ステップ1：サンプル調製：サンプルの等量分割と核酸抽出
サンプルの等量分割/リフォーマット
プライマリチューブに、血液や組織など、さまざまな種類のサンプルを採取します。サンプルを等量に分割、またはリフォーマットする手順には、各サンプルの一部をプライマリチューブから、核酸抽出や長期保存に適したフォーマットに移すことが含まれます。
当社のソリューション：ASSIST PLUS 分注ロボットの使用をおすすめします。VOYAGERチップ間隔可変電動ピペットと組み合わせることで、このステップを自動化することができます。ASSIST PLUSでは、ルーティンのピペット作業をハンズフリーで実行でき、研究室の科学的発見の加速に役立っています。このプラットフォームは汎用性が高く、当社のVOYAGERや VIAFLOマルチチャンネル電動ピペット、あるいはD-ONEシングルチャンネル分注モジュールと組み合わせて、これらすべてを自動化できます。
ASSIST PLUSを使用したチューブからプレートへのサンプルリフォーマットの方法については、すぐに使えるready-to-useのスクリプトを掲載したアプリケーションノートをご確認ください。
手作業でのワークフローをご希望の場合は、ASSIST PLUSを使わず、VOYAGERのみを使用することもできます。VOYAGERはボタンを押すだけでチップ間隔が変わり、フォーマットの異なる実験容器間で複数のサンプルを同時に移動できるため、生産性が向上します。
核酸抽出
核酸抽出は、磁気ビーズなど様々な方法で実行できます。この手順の後、採収されたDNAやRNAは、まず品質チェックにかけられ、ライブラリー調製の要件を満たしているかが確認されます。品質評価の方法としては、蛍光ベースの濃度測定、完全性確認のためのゲル電気泳動、汚染物質検出のための光学濃度測定（A260/A280やA260/A230 比）などがあります。
当社のソリューション：核酸抽出に磁気ビーズをご利用の場合、MAG／HEATMAGモジュールと、ASSIST PLUS分注ロボットまたはVIAFLO 96／VIAFLO 384電動プレート分注機との組み合わせがおすすめです。この組み合わせによって、磁気ビーズワークフローを半自動または全自動で実行でき、手作業によるミスの排除と、生産性および再現性の最適化が実現します。MAG／HEATMAGモジュールは、強力な磁石を備えており、これが自動的に上下に動くことで、迅速かつ正確にビーズを捕集します。さらに、HEATMAGは最高65℃までの温度を制御可能な加熱機能を内蔵しており、溶解と溶出の効率を高めて収量を最大化できます。
ステップ2：ライブラリー調製：シーケンシングに供する核酸の調製
ライブラリー調製は、抽出したDNAやRNAフラグメントを、シーケンシングに適したフォーマットに変換する作業です。一貫性と再現性を確保するためには、正確なリキッドハンドリングが非常に重要で、特に、正確なサイズのDNAフラグメントを得るために磁気ビーズベースのサイズ選択を行う場合は極めて重要となります。
NGSライブラリー調製には、通常、主に以下の3つのステップが含まれます。
- フラグメンテーション： 超音波処理などの物理的方法あるいは非特異的エンドヌクレアーゼなどの酵素的方法を用いてDNAを断片化し、シーケンシングに適した、より小さな扱いやすいサイズのフラグメントを生成します。
- NGSライブラリー生成：NGSプラットフォームに特異的なアダプターを追加し、マルチプレックスPCRのためのインデックス（バーコード）が組み込まれることもあります。
- サイズ選択／クリーンアップ：PCRで生成されたライブラリーを精製して、プライマー、プライマーダイマー、塩類、ポリメラーゼなどの不要なコンポーネントを除去することで、シーケンシングに供する準備のできたクリーンなサンプルが出来上がります。サイズ選択の手順は、シーケンシングに必要なサイズのDNAフラグメントを単離するためにも使えます。
システムを自動化させることで、ワークフローを効率化しながら、精度を高め、人為的ミスを最小限に抑えて、シーケンシングデータの精度と信頼性を向上できます。
当社のソリューション：MIRO CANVASは、NGSライブラリー調製プロトコルの完全自動化を可能にするマイクロ流体プラットフォームで、酵素的フラグメンテーション、PCRステップ、ビーズクリーンアップのすべてを1回のランで実行できます。
MIRO CANVASを使用してNGSライブラリー調整プロトコルを自動化する方法については、当社のアプリケーションノートをご確認ください。
あるいは、MAG／HEATMAGモジュールをASSIST PLUSまたはVIAFLO 96／VIAFLO 384ベンチトップ式リキッドハンドリングプラットフォームと組み合わせることで、磁気ビーズワークフローを実行できます。
ASSIST PLUSを使用してNGSサイズ選択ワークフローを自動化する方法については、すぐに使用できるready-to-useのスクリプトを掲載した当社のアプリケーションノートをご確認ください。
ステップ3：品質管理：定量化、ノーマライゼーション、プーリング
品質管理は、ライブラリーが正しく調製されていることを保証し、エラーの削減、データ精度の向上、信頼性の高いシーケンス結果を実現するためのステップです。これは次の3つのステップに分けることができます。
- 定量化：ライブラリー中のDNA濃度を測定することで、適切な量の材料がシーケンサーに供されることを確認します。
- ノーマライゼーション：サンプル濃度を均一なレベルに調整することで、シーケンシング中に各サンプルが均等に存在するようにします。
- プーリング：標準化されたサンプルを均等に組み合わせることで、シーケンシングの効率とスループットを最大化しながら、バランスのとれた存在量を確保するようにします。
当社のソリューション：定量化、ノーマライゼーション、プーリングのピペット作業ステップは、ASSIST PLUS分注ロボットにD-ONEモジュールを取り付けることで自動化できます。このソリューションは、ワークリストの作成とピペット作業ステップの実行を容易にする専用のソフトウェアコマンドを搭載しているため、複雑なリキッドハンドリング作業を安心してハンズフリーで実行できます。
ステップ4：シーケンシング
NGSは、Illumina、Oxford Nanopore、PacBioといった企業が提供するさまざまなテクノロジーを使って実施することができます。これら各種技術の仕組みの詳細については、当社のブログのDNAシーケンシング法をご確認ください。また、サンガーシーケンス vs. NGSのブログでは、それらの長所と短所をまとめています。