Für die HLA-Typisierung werden verschiedene Methoden verwendet. In diesem Beitrag stellen wir die verschiedenen Verfahren vor und zeigen, wie der ASSIST PLUS-Pipettierroboter das Pipettieren mit Mehrkanalpipetten automatisieren kann. Dadurch werden die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse verbessert und der zeitliche Aufwand für die Labormitarbeitenden sinkt.

Serologische HLA-Typisierung mit dem Terasaki-Tray

Bei der serologischen HLA-Typisierung verwendet man Antikörper, um die verschiedenen HLA-Antigenvarianten zu differenzieren. Ein Panel HLA-spezifischer Antikörper wird mit dem Spenderserum vermischt. So kann einerseits festgestellt werden, ob eine immunologische Reaktion auftritt, und anderseits können die von den Zellen exprimierten HLA-Muster identifiziert werden. Vor der Transplantation erfolgt eine serologische Typisierung mit abschließendem Crossmatch. Damit lassen sich vorhandene Antikörper auffinden und die HL-Antigene von Empfänger und Spender vergleichen. Für diese Untersuchung wird das Serum des Patienten mit Lymphozyten des Spenders gemischt.

Bei beiden Anwendungen kommt eine spezielle Platte, der sogenannte Terasaki-Tray, zum Einsatz. Er enthält 60 oder 72 Vertiefungen mit einem Volumen von jeweils 10 µl. Durch Zusatz von Mineralöl wird eine Verdunstung des Probenmaterials aus der Platte vermieden. Das präzise Pipettieren solch kleiner Volumina in das Öl in der Mitte jeder Vertiefung ist schwierig und kann selbst für sehr erfahrene Laborkräfte eine Herausforderung darstellen. Mit der VOYAGER-Pipette mit einstellbarem Spitzenabstand und dem ASSIST PLUS lässt sich dieser Vorgang trotz der besonderen Abmessungen der Terasaki-Trays automatisieren. Der automatische Ablauf gewährleistet stets eine korrekte Positionierung der Pipettenspitze, so dass sich kleine Volumina präzise und genau mit gleichbleibender Eintauchtiefe und Geschwindigkeit dispensieren lassen. Für noch mehr Effizienz bietet INTEGRA einen speziell konzipierten Adapter für diese Anwendung, mit dem sich bis zu zwei Terasaki-Platten in einer Reihe bearbeiten lassen. Dies erhöht den Durchsatz und verkürzt die Arbeitszeit am Gerät.

HLA-Typisierung mit ELISA und Luminex®

Eine Serotypisierung kann auch mittels ELISA-Assay durchgeführt werden, um die Reaktivität zwischen Spender-HLA und Empfängerantikörpern zu ermitteln. Im Vergleich zum standardmäßigen ELISA ist der Luminex-Test ein bead-basiertes Immunoassay-System, das den gleichzeitigen Nachweis von bis zu 100 Analyten ermöglicht und eine höhere Sensitivität und Spezifität bei der HLA-Typisierung bietet. Daher gehört er heute bei der Organtransplantation weltweit zum klinischen Standard für die Identifizierung spenderspezifischer HLA-Antikörper.

Die ELISA- und Luminex-Assays werden beide auf Mikrotestplatten mit normalerweise 96 Vertiefungen durchgeführt und ermöglichen eine effiziente Bearbeitung mit den elektronischen VIAFLO-Mehrkanalpipetten. Durch Einklicken der Pipette in den ASSIST PLUS lassen sich die einzelnen Schritte des ELISA-Verfahrens automatisch abwickeln. Für ausgelastete klinische Labors bedeutet dies eine wichtige Zeiteinsparung. Gleichzeitig werden Ergebnisvariationen von einem Bediener zum nächsten vermieden. Die mühsamen Pipettierschritte des Immunoassays – Beschichten der Platte, Übertragen der Proben, Zugeben von Nachweisantikörpern und Beenden der Reaktion – lassen sich mit dem ASSIST PLUS-Pipettierroboter problemlos automatisieren. Eine detaillierte Beschreibung dieser Applikation finden Sie hier.

Molekulare HLA-Typisierung

Klinische Strategien für die molekulare HLA-Typisierung wurden entwickelt, als man erkannte, dass sich bestimmte HLA-Varianten nicht serologisch, sondern nur durch Untersuchung der entsprechenden Gene differenzieren lassen. Heute gibt es eine Reihe sequenzbasierter HLA-Typisierungsprotokolle wie PCR-SSP (PCR Sequence-Specific Primer), PCR-SSOP (PCR Sequence-Specific Oligonucleotide Probe), PCR-SBT (PCR Sequence-Based Typing) und NGS (Next Generation Sequencing). Bei allen molekularen HLA-Typisierungsmethoden isoliert man zunächst die Nukleinsäuren aus der Probe und amplifiziert dann mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die Zielregion; diese kann aus der gesamten HLA-Region, einem Gen in voller Länge oder bestimmten HLA-Exonen bestehen. Da das HLA-System ein großer Genkomplex mit 3.600 Kilobasen ist, sind zur Typisierung einer einzigen Probe zahlreiche PCR-Reaktionen erforderlich.

INTEGRA bietet mit dem ASSIST PLUS-Pipettierroboter ein optimales System für die Nukleinsäureextraktion aus Proben und für die Automatisierung der PCR-Setups für die molekulare HLA-Typisierung. So wird die Arbeitszeit am Gerät deutlich verringert und die Gesamtkosten pro Probe sinken. Da sich selbst PCR-Tests mit 384-Well-Platten problemlos automatisieren lassen, können Proben in großer Zahl effizient typisiert werden. Durch die Automatisierung mit den VOYAGER-Pipetten mit einstellbarem Spitzenabstand und dem ASSIST PLUS lassen sich Proben aus Röhrchen parallel im Mehrkanalverfahren auf die Platten transferieren. Damit werden auch kleine Volumina garantiert genau und präzise übertragen. Zudem lässt sich durch die Kombination mit den Mehrkanal-Reagenz-Reservoiren von INTEGRA der Verbrauch kostspieliger Reagenzien senken, da das SureFlo™ Anti-Abdichtungsrelief des Reservoirs für das branchenweit geringste Totvolumen sorgt. Bei Bedarf können die Proben während des Setups durch die Verwendung von Adaptern für das Reservoir und einen 96- oder 384-Well-PCR-Kühlblock gekühlt werden.

Beim SBT- und NGS-Verfahren muss die Quantifizierung und Aufreinigung der Amplikone nach dem PCR-Schritt erfolgen. Typischerweise wird die Aufreinigung mit magnetischen Beads durchgeführt. Dank seines flexiblen Deckaufbaus kann der ASSIST PLUS mit Magnetplatten arbeiten, so dass aufwändige Pipettierschritte während der Aufreinigung automatisiert werden können. Eine maximale Probenrückgewinnung wird durch die optimale Einstellung von Pipettierparametern wie Eintauchtiefe, Pipettiergeschwindigkeit und Spitzenwinkel erzielt. Dies gewährleistet eine einheitliche Positionierung der Spitze in der Wells. Die Gefahr einer Störung oder Verschleppung der Beads wird vermindert, was zu einer hohen Probenausbeute und Reinheit für die nachfolgende Sequenzanalyse führt.

Fazit

Bedienfehler oder ungenaues Liquid-Handling bei der HLA-Typisierung können schwerwiegende Folgen haben, wenn es hierdurch zu einer mangelnden Übereinstimmung (Mismatch) zwischen Patient und Spender kommt. Eine Automatisierung des Arbeitsablaufs kann solche Risiken reduzieren. Mit dem ASSIST PLUS-Pipettierroboter lassen sich kleinere Volumina genauer und präziser pipettieren als auf manuellem Weg. Dies ist besonders bei kleinen und wertvollen Proben wichtig. Der ASSIST PLUS kann mit einer der 25 elektronischen Mehrkanalpipetten von INTEGRA kombiniert werden, die unterschiedliche Volumina und eine Vielzahl von Pipettierkanälen bieten. Damit ist mehr als eine HLA-Typisierungsmethode und eine einfache Umstellung zwischen verschiedenen Prozessen und Anwendungen entsprechend den Anforderungen des Workflows möglich. Durch die Automatisierung mit den VOYAGER-Pipetten mit einstellbarem Spitzenabstand und dem ASSIST PLUS können selbst Terasaki-Trays oder Röhrchenracks verarbeitet werden, was die Produktivität steigert. Der ASSIST PLUS ist somit ein vielseitiges Instrument für Diagnostiklabors, Transfusions- und Transplantationszentren, die ihre Kapazitäten bei der HLA-Typisierung erhöhen wollen.