Mikroorganismen können als Reaktion auf den übermäßigen oder falschen Einsatz von Antibiotika im Laufe der Zeit eine genetische Resistenz erwerben, wodurch gängige Infektionen sich nicht nur schwer behandeln lassen, sondern auch lebensbedrohlich sein können. In den letzten Jahren sind multiresistente Erreger (MRE) zu einem ernsten Gesundheitsproblem geworden, denn die Morbiditäts- und Mortalitätsraten aufgrund von Antibiotikaresistenz steigen weltweit rapide an. Daher zielt die Diagnostik jetzt auf ein schnelles und genaues Erkennen von Arzneimittelresistenzen ab, damit einerseits nicht von vornherein ungeeignete Antibiotika verschrieben werden und andererseits der Behandlungserfolg gesteigert und die Genesung der Patienten beschleunigt werden kann.  

Herkömmliche Ansätze zur Prüfung der Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika

Zur Messung der antimikrobiellen Empfindlichkeit eines Erregers verwendet man in der Regel den Test der minimalen Hemmkonzentration (minimum inhibitory concentration, MIC). Das lässt sich mit Brühen- oder Agarverdünnungen, Antibiotikagradienten oder Scheibendiffusionsverfahren ermitteln. Näheres dazu in unserem Blog über antimikrobielle Empfindlichkeit. Diese phänotypischen Techniken haben zweifellos ihre Vorteile, aber auch einige Nachteile. Zum Beispiel erfordern sie arbeits- und zeitaufwändige sowie fehleranfällige manuelle Pipettierschritte. Dadurch wird der Arbeitsablauf im Labor erheblich verlangsamt und es kommt zu langen Durchlaufzeiten.    

Mit den automatisierten Pipettierplattformen von INTEGRA Biosciences lassen sich solch aufwändige Pipettierroutinen erheblich beschleunigen und ein höherer Durchsatz sowie kürzere Zeiten bis zum Vorliegen von Ergebnissen erzielen als mit manuellen MIC-Tests. In unserem Anwendungsbericht Automated Minimum Inhibitory Concentration Testing geht es speziell um die Methode der Brühenverdünnung. Er enthält eine ausführliche Anleitung zur Verwendung des ASSIST PLUS-Pipettierroboters zusammen mit der VOYAGER-Pipette mit einstellbarem Spitzenabstand, um Transfer- und Mischschritte zu automatisieren und gleichzeitig konstante Pipettierhöhen, -geschwindigkeiten und -mischparameter für genaue, präzise und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Jetzt mehr lesen zu INTEGRAs Pipettierlösungen ohne Aufsicht für Verdünnungsreihen bei MHK-Tests.  

Molekulare Diagnostik als neue Taktik im Kampf gegen Antibiotikaresistenz

Molekulare Diagnosetechniken entwickeln sich zum bestmöglichen Instrument, um sowohl Krankheitserreger als auch ihre Resistenzmechanismen zu ermitteln, d.h. entweder als Alternative oder als Ergänzung zu herkömmlichen Methoden. Genotypische Tests sind in der Regel präziser als herkömmliche Tests auf der Basis von Kulturen. Sie sind zudem schneller und liefern Ergebnisse in nur einer Stunde, da der Erreger für die Tests nicht isoliert und kultiviert werden muss.   

Genotypische Methoden ermöglichen den direkten Nachweis spezifischer Resistenzgene sowie neu aufgetretener Mutationen (Tabelle 1) und lassen sich in der Regel in drei Kategorien unterteilen, d.h. Methoden, die auf Amplifikation, Sequenzierung oder Hybridisierung aufbauen. Im Folgenden geht es um die beiden ersten Methoden mit Amplifikation bzw. Sequenzierung.

Auf Amplifikation aufbauende Techniken

Ein Beispiel für diese Techniken ist die häufig verwendete nukleinsäurebasierte Amplifikationstechnik (nucleic acid-based amplification technique, NAAT), bei der die Zielgensequenz amplifiziert wird, um den Nachweis zu ermöglichen. Die am weitesten verbreitete NAAT-Methode ist die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR). Die Echtzeit-PCR (oder qPCR) liefert schnelle, quantitative, zielspezifische Ergebnisse, was besonders für den Nachweis von multiresistenten Erregern bei Point-of-Care-Tests nützlich ist, bei denen sich Multiplex-Panels zum gleichzeitigen Erkennen mehrerer genetischer Resistenzmarker verwenden lassen. 

Mehrere Phasen des NAAT-Workflows sind gut geeignet, um den Durchsatz mit Mehrkanalpipetten oder durch Automatisierung zu erhöhen. Wir bieten eine Vielzahl von Lösungen für erhöhten Durchsatz bei NAAT-Workflows an. So lässt sich beispielsweise die tragbare elektronische MINI 96-Pipette durch das parallele Hinzufügen von 96 Proben oder Reagenzien für eine rasche Probenextraktion und qPCR-Vorbereitung verwenden. Alternativ lässt sich mit dem ASSIST PLUS-Pipettierroboter der Nukleinsäure-Extraktionsprozess automatisieren, und somit können die Anwender DNA-Material in gleichbleibend hoher Qualität aus den Proben gewinnen. Tatsächlich lässt sich der gesamte Arbeitsablauf der PCR-Probenvorbereitung mit dem ASSIST PLUS-Pipettierroboter automatisieren, was zudem Zeit für manuelle Tätigkeiten einspart und den Gesamtdurchsatz des Labors erhöht.   

Auf Sequenzierung aufbauendes Verfahren

Einige genetische Resistenzmarker lasen sich aufgrund ihrer hohen Sequenzvariationen nicht per qPCR-Analyse identifizieren. Daher ist das Aufreinigen der qPCR-Produkte nötig, um sie mittels klassischer oder Sanger-Sequenzierungsanalyse weiter sequenzieren zu können. Das Lösungsangebot von INTEGRA setzt genau hier an. So lässt sich beispielsweise die handgesteuerte elektronische VIAFLO 96-Pipette verwenden, um diesen zusätzlichen Aufreinigungsschritt zu beschleunigen, mit zuverlässigeren Ergebnissen und erheblicher Zeitersparnis. Da die Sanger-Sequenzierung jedoch nur jeweils auf ein Resistenzgen abzielt, verwendet man in den letzten Jahren zunehmend eine andere auf Sequenzierung aufbauende Methode: das sogenannte Next Generation Sequencing (NGS).  

NGS ermöglicht einen höheren Durchsatz und kann entweder amplikonspezifisch sein – was schneller ist – oder das gesamte Genom umfassen. In letzterem Fall wird von Deep Sequencing gesprochen. NGS ist sehr empfindlich und benötigt nur sehr geringe Flüssigkeitsmengen, so dass genaues Pipettieren ausschlaggebend ist. Die langwierigen Pipettierprotokolle können das Personal strapazieren, was das Automatisieren der umfangreichen Liquid-Handling-Schritte in modernen Labors rechtfertigt. Viele mit der Sequenzierung zusammenhängende mühsame Aufgaben – wie z. B. das Pooling und Hit-Picking positiver Proben – lassen sich mit dem ASSIST PLUS-Pipettierroboter und dem Einkanal-Pipettiermodul D-ONE vollständig automatisieren. Das steigert die Produktivität des Labors und verbessert die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Das gleiche System lässt sich auch für das mühelose Normalisieren von DNA-Bibliotheken verwenden. Diese innovativen und ergonomischen Produkte minimieren ferner die Fehleranfälligkeit, körperliche Belastung und das Risiko, schädlichen Mikroorganismen ausgesetzt zu werden, was bei AST zweifellos oberste Priorität hat.     

Multiresistente Keime bezwingen

Die Entwicklung neuer Antibiotika nimmt viel Zeit in Anspruch, so dass Ärzte die aktuell verfügbaren Antibiotika mit Bedacht einsetzen müssen. Dank schnellem Erkennen multiresistenter Erreger können Patienten möglichst schnell und angemessen behandelt werden, ihre Genesung beschleunigt sich und die Wahrscheinlichkeit positiver Behandlungsergebnisse nimmt zu. Das Automatisieren mit robusten, qualitativ hochwertigen Pipettierplattformen ist für rasches Erkennen von Antibiotikaresistenzen ausschlaggebend. Die innovativen Produkte von INTEGRA sind daher eine lohnende Investition in diesem ständigen Kampf.