Die PCR-Aufreinigung ist unerlässlich, wenn unerwünschte Verbindungen entfernt werden sollen, die nachgelagerte Anwendungen stören könnten, und damit sichergestellt ist, dass nur die Amplicons verbleiben, die von Interesse sind. Dies gelingt in der Regel mit einer PCR-Aufreinigung mit magnetischen Beads oder Spin-Säulen. Wir bieten Lösungen für beide Ansätze an, empfehlen jedoch die PCR-Aufreinigung mit magnetischen Beads, da diese Protokolle leicht zu automatisieren sind, durch Automatisierung Zeit sparen und gleichzeitig helfen, Fehler zu reduzieren und die Reproduzierbarkeit Ihrer Ergebnisse zu erhöhen.

Wie funktioniert die Aufreinigung mit magnetischen Beads?

Die PCR-Aufreinigung mit magnetischen Beads ist ein dreistufiger Prozess, der Bindung, Waschen und Elution umfasst. Die Schritte der Flüssigkeitsverarbeitung können auf Benchtop-Plattformen automatisiert werden, wodurch die mühsamen Zentrifugations- und Vakuumverteilerschritte entfallen, die mit Spin-Säulen-Protokollen verbunden sind. Dies verbessert die Reproduzierbarkeit der Prozesse, erhöht den Durchsatz und spart Zeit.

Schritt 1: Binden

Zunächst werden der Probe magnetische Beads in einem präzisen Verhältnis von Beads zu Probe zugesetzt, in der Regel im 1,8-fachen Verhältnis, um DNA-Fragmente <100 bp effektiv zu entfernen. Es folgen Mischzyklen und Inkubation, um die Bindung der DNA-Amplicons an die Beads zu fördern. Anschließend werden die an die Beads gebundenen Amplicons magnetisch abgetrennt, sodass der Überstand (der kleinere DNA-Fragmente wie Primer und Primer-Dimere enthält) leicht abgesaugt und verworfen werden kann. Auf diese Weise werden auch die Nukleinsäuren isoliert.

Schritt 2: Waschen

Andere unerwünschte Komponenten – nicht inkorporierte dNTPs, Enzyme und Salze – werden durch Zugabe von Ethanol zur Probe, Mischen und Wiederholung der magnetischen Trennung weggewaschen. Das Ethanol, das die unerwünschten Bestandteile enthält, wird abgesaugt und entsorgt. Lufttrocknung sorgt für die vollständige Verdampfung des restlichen Lösungsmittels, was Störungen bei nachgeschalteten Anwendungen entgegenwirkt.

Schritt 3: Elution

Schließlich wird ein salzarmer Elutionspuffer oder nukleasefreies Wasser hinzugefügt, um die getrockneten Beads zu resuspendieren und die gebundene DNA – die Amplikons – wieder der Lösung zuzufügen. Anschließend werden die Beads durch magnetische Trennung vom Eluat isoliert, sodass hochwertige, gereinigte DNA für die nachgeschalteten Anwendungen gewonnen werden kann.

Wie Sie Ihre PCR-Aufreinigungsprotokolle mit magnetischen Beads rationalisieren

Wir bieten eine Reihe von Lösungen an, welche die Arbeit im Labor so einfach wie möglich machen und die Effizienz der Arbeitsabläufe bei der PCR-Aufreinigung mit magnetischen Beads verbessern.

• MAGFLO™ NGS magnetische Beads für die NGS Grössenselektion und PCR-Aufreinigung*: MAGFLO NGS magnetische Beads ermöglichen hohe Wiederfindungsraten von Amplicons. Sie können eine kostenlose 1-ml-Probe bestellen, um das Produkt selbst zu testen.
• MAG-Modul: Unser Magnetmodul ist eine nützliche Alternative zu herkömmlichen Magnetständern. Automatisierte vertikale Magnetbewegungen bedeuten, dass Sie Röhrchen und Platten nicht mehr zu und von Magnetständern transportieren müssen, wodurch das Risiko des Verschüttens entfällt. Zudem werden die Beads an einer Stelle gesammelt, anstatt ein ringförmiges Pellet zu bilden, was das störungsfreie Absaugen des Überstands erleichtert. Es gibt eine Vielzahl von Adaptern für verschiedene Labortypen, die eine perfekte Passform zwischen den Probengefäßen und den Magneten ermöglichen, um sicherzustellen, dass alle Beads erfasst werden und eine hohe Ausbeute gewährleistet ist. Um Ihre Produktivität weiter zu steigern, kann das MAG-Modul mit unseren Benchtop-Plattformen – den elektronischen Handpipetten VIAFLO 96 und VIAFLO 384 und dem ASSIST PLUS-Pipettierroboter – für halb- oder vollautomatische Arbeitsabläufe kombiniert werden.
• ASSIST PLUS-Pipettierroboter: Der ASSIST PLUS-Pipettierroboter ermöglicht die Automatisierung unserer elektronischen Mehrkanalpipetten und die Integration des MAG-Moduls, womit vollautomatische PCR-Aufreinigungsabläufe möglich sind. Im Gegensatz zu größeren Liquid-Handling-Robotern kann diese erschwingliche Lösung ohne Programmierkenntnisse eingerichtet werden. INTEGRA stellt Ihnen auch Skriptvorlagen zur Verfügung.
• VIAFLO 96 und VIAFLO 384 elektronische Handpipetten: Setzen Sie auf einen halbautomatischen Flüssigkeitstransfer mit unseren VIAFLO 96- und VIAFLO 384-Pipetten, die das gleichzeitige Pipettieren von 96 oder 384 Proben ermöglichen. In Kombination mit einem MAG-Modul eignen sie sich ideal für Arbeitsabläufe mit einem hohen Durchsatz bei der Aufreinigung mit magnetischen Beads in ganzen Platten. Unser Anwendungshinweis Zuverlässige Durchlaufzeit mit einem PCR-Aufreinigungsprotokoll mit hohem Durchsatz unter Verwendung von magnetischen Beads erklärt alles, was Sie wissen müssen.

Wie funktioniert die Aufreinigung mit Spin-Säulen?

Die PCR-Aufreinigung mit Spin-Säulen besteht aus Bindungs-, Wasch- und Elutionsschritten, ähnlich wie bei Arbeitsabläufen auf Basis magnetischer Beads. Spin-Säulen enthalten eine Membran mit einer Affinität für Nukleinsäuren und werden in Mikrozentrifugenröhrchen eingesetzt. Die Proben werden in die Spin-Säule überführt und zentrifugiert, um DNA-Amplicons einer bestimmten Größe zu isolieren. Diese binden sich an die Membran, während die meisten unerwünschten Komponenten durchgelassen werden, auch Primer und Primer-Dimere. Unerwünschte Bestandteile können durch Zugabe eines Waschpuffers zur Spin-Säule und anschließende Zentrifugation entfernt werden. Schließlich wird der Elutionspuffer zugegeben und die Säule erneut zentrifugiert, was dazu dient, die gereinigten DNA-Amplicons von der Membran zu lösen.

Spin-Säulen sind als Einzelsäulen oder als 96-Well-Silica-Membranplatten erhältlich, die auf einen Vakuumverteiler gesetzt werden können, anstatt zentrifugiert zu werden, sodass Sie den Arbeitsablauf für einen höheren Durchsatz anpassen können. Die Spin-Säulen-Methode hat jedoch einige Nachteile im Vergleich zur Aufreinigung mit magnetischen Beads. Die Membranen können leicht verstopfen und das minimale Elutionsvolumen ist größer, was zu geringeren DNA-Konzentrationen führt. Der Arbeitsablauf umfasst auch mehrere praktische Schritte mit einer Zentrifuge oder einem Vakuumverteiler, die schwer zu automatisieren sind und das Risiko menschlicher Fehler erhöhen.

Wie Sie Ihre PCR-Aufreinigungsprotokolle mit Spin-Säulen rationalisieren

Eine Reihe unserer Lösungen für die Handhabung von Flüssigkeiten kann zur Rationalisierung Ihrer Arbeitsabläufe mit Spin-Säulen eingesetzt werden, darunter:

• VOYAGER-Pipetten mit einstellbarem Spitzenabstand: VOYAGER-Pipetten können den Spitzenabstand auf Knopfdruck automatisch einstellen, sodass Sie Puffer problemlos aus Reservoiren auf Spin-Säulen oder Silica-Membranplatten übertragen können und nicht mehr mit Einkanalpipetten arbeiten müssen.
• VIAFLO 96 und VIAFLO 384: Diese 96- und 384-Kanal-Pipetten ermöglichen das parallele Pipettieren von Puffern in alle 96 Wells einer Silica-Membranplatte, wodurch sich der Zeitaufwand für die Handhabung verringert. In unserem Anwendungshinweis PCR-Produktaufreinigung mit dem QIAquick® 96 PCR Purification Kit und der VIAFLO 96 elektronischen Handpipette erläutern wir die Vorteile dieser Pipetten.

Erfahren Sie mehr über unsere Lösungen zur Optimierung Ihrer Nukleinsäure-Aufreinigungsanwendungen.

* MAGFLO NGS Beads sind nur in Belgien, Dänemark, Deutschland, Frankreich, Großbritannien, Irland, Niederlande, Österreich, Schweden und der Schweiz erhältlich.