Vorsichtiges Pipettieren reduziert den Stress auf Zellen in Kulturen

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Vorsichtiges Pipettieren reduziert den Stress auf Zellen in Kulturen

Der unsichtbare Einfluss von Stress

Es gibt verschiedene Parameter, die sich auf die Zellviabilität auswirken, wie z.B. Umgebungsbedingungen, Passagenanzahl und medienbezogene Faktoren. Allerdings kann sich jede Variable – bis hin zu Unterschieden in Handling-Methoden – auf die Zellgesundheit und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse  auswirken. Einige von diesen Wirkungen sind klar erkennbar und können deshalb auch leichter gesteuert werden. Bei einer mikrobialen Kontamination  wachsen zum Beispiel erkennbare bzw. sichtbare Strukturen und Kolonien wobei ältere Zellen charakteristische Phänotypen mit Seneszenz bilden können. Doch der Einfluss von Stress auf die Viabilität kann nur während oder nach der Kultivierung erkannt werden oder durch spezielle Färbung. Scherkräfte sind ein unumgänglicher Stressfaktor, dem Zellen während der Pipettierung, dem Kapillartansfer und der Zentrifugation ausgesetzt sind. Sie können die Zellviabilität und -proliferation signifikant verringern.1 Die Meinungen darüber, in welchem Ausmaß Zellen Scherkräfte aushalten können, sind unterschiedlich.2 Jedoch herrscht Übereinstimmung, dass die Überschreitung der Grenze die Zellgesundheit schädigt, was zu Konsequenzen wie ungewollte Lyse der Zelle oder zum Zelltod führt. Die Auswirkungen von Scherkräften auf die Zellviabilität sind nicht immer unmittelbar evident;3 signifikante Reduktionen der Viabilität wurden bis zu 24 Stunden nach der Einwirkung der Kräfte berichtet.4

Für viele wichtige Schritte im Zellkulturarbeitsprozess - wie z.B. Zelltrennung, Sampling, Aussaat und zellbasierte Assays - ist das Mischen mit einer Pipette notwendig. Wenn das nicht vorsichtig gemacht wird, kann es zum Ausscheren von Zellen an der Öffnung der Spitze kommen. Vergleichbar mit dem Durchqueren von Menschenmassen in einer U-Bahn kann es zu einem Zelltrauma führen, wenn Zellen durch eine zu enge Röhre oder mit einer zu hohen Geschwindigkeit gezwungen werden. Zellviabilität, -ausbreitung und -proliferation werden alle beeinträchtigt, wenn der Durchmesser der Spitze kleiner ist oder die Durchflussmenge höher ist.5 Bei breiten Spitzen hat die Öffnung einen größeren Durchmesser, so dass der Stress auf die Zellen reduziert ist. Aber dies löst nur die Hälfte des Problems. Wenn mit manuellen Pipetten gearbeitet wird, dann unterscheidet sich jeder Mischvorgang geringfügig. Abrupte Starts und Stopps und Variationen der Kolbengeschwindigkeit sind unausweichlich. Aus diesem Grunde kann die Zahl der notwendigen Mischschritte zum Ablösen oder zur Separierung der Zellen variieren. Durch diese Geschwindigkeitsvariationen bei der Mischung und Pipettierung kann es zu unterschiedlichen Ausprägungen der Scherkräfte kommen, was sich auf die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auswirkt.

Forscher pipettiert Zellkulturmedium in 24-Well-Platte mit INTEGRA-Pipette

Scherkräfte und andere Ursachen schlechter Zellgesundheit können signifikante Konsequenzen für die Reproduzierbarkeit der Forschung und die Produktivität von zellbasierten Herstellungsverfahren haben. Das oberste Ziel bei Zellkulturmanipulationen sind hohe Erträge von gesunden Zellen. Unerwartete Variationen in der Zellviabilität durch diese Art von Stress kosten den Wissenschaftler kostbare Zeit und Geld. Wenn die Auswirkungen dieser Kräfte nicht gut verstanden oder identifiziert werden, können falsche Schlüsse über die Viabilität von Zellen oder die Phänotypen, die durch schlechte Zellgesundheit entstehen, gezogen werden. In Zytotoxizitätsassays kann zum Beispiel die Wirkung von toxischen Arzneistoffen auf die Zellviabilität überschätzt werden, wenn die Zellen auch Scherkräften ausgesetzt sind. Vorsichtige Zellhandlingmethoden können dazu beitragen, die Auswirkungen dieser Art von Stress auf die Zellgesundheit zu reduzieren.

Eine Lösung, die weiter geht

Die Zellviabilität kann durch sanftes Handling und die richtigen Instrumente verbessert werden. Es ist immer gut, wenn man sich bei der Pipettierung von fragilen Zellproben für breite Spitzen entscheidet, da sie eine größere Öffnung haben und die Zellen leichter hindurchfließen können. Hochentwickelte elektronische Pipetten können auch dazu beitragen, Variationen in der Pipettierleistung zu vermindern. Die Anwender können Pipettierprotokolle mit definierten Dispensiergeschwindigkeiten und Mischabläufen wählen, dokumentieren und speichern, so dass jede Aktion jedes Mal in der gleichen Geschwindigkeit durchgeführt wird. Diese Moduseinstellungen sind oft vorprogrammiert, aber sie können auch individuell programmiert werden, passend zu den Erfordernissen der Applikation. Das eliminiert den Einfluss der Anwenderarbeitsweise oder der Anwendererfahrung auf die Qualität und Konsistenz des Zell-Handlings, so dass die versteckten Auswirkungen von Scherkräften auf die Zellviabilität reduziert werden und ein höherer Ertrag an gesunden Zellen erzielt wird - mit einer unübertroffenen Reproduzierbarkeit bei allen Arbeiten mit Zellen.

Forschende aspiriert Flüssigkeit aus 96-Well-Platte
  1. Shi, J., Wu, B., Li, S., Song, J., Song, B., & Lu, W. F. (2018). Shear stress analysis and its effects on cell viability and cell proliferation in drop-on-demand bioprinting. Biomedical Physics & Engineering Express, 4(4), 045028.
  2. Brindley, D., Moorthy, K., Lee, J. H., Mason, C., Kim, H. W., & Wall, I. (2011). Bioprocess forces and their impact on cell behavior: implications for bone regeneration therapy. Journal of tissue engineering, 2011.
  3. Zoro, B. J. H., Owen, S., Drake, R. A. L., & Hoare, M. (2008). The impact of process stress on suspended anchorage‐dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnology and bioengineering, 99(2), 468-474.
  4. Mulhall, H., Patel, M., Alqahtani, K., Mason, C., Lewis, M. P., & Wall, I. (2011). Effect of capillary shear stress on recovery and osteogenic differentiation of muscle‐derived precursor cell populations. Journal of tissue engineering and regenerative medicine, 5(8), 629-635.
  5. Agashi, K., Chau, D. Y., & Shakesheff, K. M. (2009). The effect of delivery via narrow-bore needles on mesenchymal cells. Future Medicine. 49-64.