Verbesserte Reproduzierbarkeit bei der Arbeit mit Zellkulturen

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Verbesserte Reproduzierbarkeit bei der Arbeit mit Zellkulturen

Variationen aufgrund des Zellhandlings

Stress

Zellkultivierungsparameter werden routinemäßig überwacht, um reproduzierbare und lebensfähige Zellen zu erzeugen. Technische Variationen beim Handling werden jedoch oft nicht berücksichtigt. Eine Analyse möglicher Variationen bei Anwendungen zur Krebsfrüherkennung ergab, dass die Ergebnisse innerhalb einer Forschungsgruppe weitaus konsistenter waren als zwischen den Gruppen, wobei bei letzteren eine 200-fache Abweichung der Wachstumshemmungsraten zu beobachten war2. Dies ist wahrscheinlich auf Unterschiede in den Versuchsmethoden, Pipettiertechniken und der Qualität der Instrumente zwischen den verschiedenen Forschungsteams zurückzuführen. Alle diese Aspekte sind Stressfaktoren, die Variationen in der Zellviabilität nach sich ziehen und die Reproduzierbarkeit von Experimenten mindern können, indem sie Zellen unterschiedlich stark belasten. Scherkräfte, denen Zellen beim Pipettieren ausgesetzt sind, insbesondere wenn sie mit zu engen Spitzen oder zu hoher Geschwindigkeit pipettiert werden, sind eine unvermeidbare Stressquelle. Ein solcher Vorgang kann zu phänotypischen Variationen oder Verhaltensänderungen führen und letztlich Abweichungen in der Zellviabilität verursachen. Daher erzielen Forschungsgruppen, die Pipettenspitzen mit weiten Öffnungen einsetzen, womöglich eine höhere Zellviabilität und gelangen zu zutreffenderen Schlussfolgerungen als Teams, die Spitzen mit Standardöffnungen verwenden.

Bei der Arbeit mit manuellen Pipetten sind Unterschiede im Neigungswinkel der Pipette sowie in der Ansaug-/Dispensiergeschwindigkeit – abhängig davon, wie schnell der Kolben nach unten gedrückt wird – zwischen verschiedenen Benutzern unvermeidlich, wodurch zusätzliche Variationen im Stressniveau entstehen. Plötzliche Starts und Stopps oder abrupte Bewegungen können Unstimmigkeiten hervorrufen, die unbemerkt bleiben, wenn sie vom Forschungspersonal nicht sofort dokumentiert werden. Elektronische Pipetten ermöglichen eine eindeutige Festlegung und Dokumentierung von Pipettier- und Mischgeschwindigkeiten, wodurch sich Unterschiede zwischen wechselnden Benutzern oder Pipettierschritten auf ein Minimum reduzieren lassen. Die Kombination von elektronischen Pipetten und Pipettenspitzen mit weiten Öffnungen verschafft den Benutzern mehr Kontrolle über die Stressfaktoren und trägt somit zur Verbesserung der Zellviabilität bei.

Forscher pipettiert Zellkulturmedium in 24-Well-Platte mit INTEGRA-Pipette

Protokollabweichungen

Voraussetzung für ein reproduzierbares Zellwachstums ist die möglichst exakte Einhaltung des durch das Forschungspersonal definierten Protokolls, denn jede Abweichung kann Unstimmigkeiten hervorrufen. So können z. B. Abweichungen in der Zahl der ausgesäten Zellen oder in der Zellverteilung im Medium Unterschiede im Zellwachstum bewirken, die sich auf die Ergebnisse auswirken. Bei Zytotoxizitätsassays kann beispielsweise die Anzahl der Zellen einen erheblichen Anstieg der minimalen Hemmkonzentration eines Antibiotikums bewirken – ein Phänomen, das man als „Inokulumeffekt“ bezeichnet –, daher muss auf Konsistenz bei der Anzahl der Zellen geachtet werden. Durch häufiges Mischen des Mediums wird für eine gleichmäßige Verteilung der Zellen gesorgt und verhindert, dass sich in der Zellkultur ein Konzentrationsgradient zwischen unteren und oberen Schichten im Behälter bildet. Zur gleichmäßigen Verteilung und Aussaat der Zellen muss diese Maßnahme von Experiment zu Experiment konsequent durchgeführt werden. Allerdings verursacht das Mischen Scherkräfte, die auf die Zellen einwirken und Stress auslösen können, daher muss auch übermäßiges Mischen vermieden werden, um Variationen bei der Zellviabilität zu verhindern. Eine möglichst exaktes Befolgen des Protokolls sowie die präzise Erfassung aller Methoden, Mischschritte und Pipettiergeschwindigkeiten können zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit vom Zellhandling beitragen.

Forschende aspiriert Flüssigkeit aus 96-Well-Platte

Kontamination

Durch die biologische Kontamination von Proben mit Mikroorganismen und die Kreuzkontamination zwischen unterschiedlichen Zelllinien können die Gesundheit der Zellen beeinträchtigt und unzuverlässige Ergebnisse erzielt werden. Wenn eine Kontamination unerkannt bleibt, kann das zu falschen Schlussfolgerungen über die Überlebensfähigkeit und das Verhalten von Zellen führen. Dies ist der Integrität und Reproduzierbarkeit der Forschung abträglich. Neben einer wirksamen Qualitätskontrolle, die Tests auf unerwünschte Mikroorganismen einschließt, sind aseptische Verfahren und Instrumente wichtig, um die Kontamination von Proben zu verhindern. Das korrekte Handling von Zellproben, Medium und Reagenzien sollte sterile Filterspitzen, sterile Pipetten und automatisierte Arbeitsabläufe beinhalten.

Sicherstellen von reproduzierbarem Handling

Durch automatisierte Arbeitsabläufe können die Reproduzierbarkeit verbessert und die Scherkräfte, die auf die Zellen einwirken, kontrolliert werden. Dadurch wird die unvermeidliche Variabilität der manuellen Abläufe beseitigt. Dies ist besonders wichtig bei hohem Probendurchsatz in 384-Well-Mikrotiterplatten, die manuell kaum ohne eine höhere Rate an Unstimmigkeiten bearbeitet werden können. Der Wechsel zu automatisierten Prozessen kann dazu beitragen, diese Variabilität zu beseitigen, und ermöglicht eine bessere Kontrolle und Homogenität.3

Idealerweise sollte jeder Pipettierschritt bei der Zellkultivierung – vom Ausplattieren bis zur Behandlung – automatisiert werden, um benutzerbedingte Variationen zu mindern. Elektronische Pipetten bieten hierfür einen einfachen und erschwinglichen Ansatz. Mit elektronischen Pipetten können Benutzer Pipettierprotokolle mit festgelegten Dispensiergeschwindigkeiten und Mischabläufen auswählen, dokumentieren und speichern, so dass jeder Schritt jedes Mal in der gleichen Geschwindigkeit durchgeführt wird, unabhängig davon, wie erfahren der Benutzer ist oder welche Technik die Benutzerin verwendet. Darüber hinaus können mit einem Repeat-Dispense-Modus größere Flüssigkeitsmengen angesaugt und in kleinen, definierten Volumen abgegeben werden. Dies hilft, Hin- und Herbewegungen zwischen Quelle und Platte, durch die ebenfalls Unstimmigkeiten und Handlingfehler entstehen können, zu minimieren. Neben den elektronischen Pipetten ist die Einheitlichkeit auch bei Laborgefäßen aus Kunststoff, einschließlich Pipettenspitzen, ein wichtiger Faktor. Auch hier ist darauf zu achten, dass immer übereinstimmende Artikel verwendet werden, denn auch abweichende Spitzenformen und -abmessungen und ein anderer Öffnungsdurchmesser können variable Auswirkungen auf Zellen zur Folge haben.

Noch konsequenter ist die Umstellung auf einen vollautomatischen Pipettierablauf unter Verwendung eines Roboters, wodurch sich Variationen, die auf die Erfahrung oder Technik von Benutzern zurückzuführen sind, vollkommen beseitigen lassen. Zwar ist in der Umstellungsphase von manuellen Methoden zu automatischen Prozessen wahrscheinlich eine gewisse Lernkurve da, bis alle Mitglieder der Forschungsgruppe mit den neuen Geräten und Verbrauchsmaterialien vertraut sind; durch einen Arbeitsablauf ohne jegliche Benutzereingriffe wird jedoch der Benutzer als versteckte Ursache von Variabilität und Kontamination aus der Gleichung entfernt und somit die Reproduzierbarkeit der Handlingtechniken verbessert.

Figure 2: Aspirating the cell culture media using a VACUBOY vacuum hand operator.
  1. Baker, M (2016). Reproducibility crisis. Nature, 533(26), 353-66.
  2. Niepel, M., et al. (2019). A multi-center study on the reproducibility of drug-response assays in mammalian cell lines. Cell systems, 9(1), 35-48
  3. Brindley, D., et al. (2011). Bioprocess forces and their impact on cell behavior: implications for bone regeneration therapy. Journal of tissue engineering.